高中生物选修3精品学案121 目的基因的获取和基因表达载体的构建.docx
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高中生物选修3精品学案121目的基因的获取和基因表达载体的构建
1.2 基因工程的基本操作程序
1.2.1 目的基因的获取和基因表达载体的构建
[学习目标] 1.说出基因工程的基本操作程序。
2.理解获取目的基因的途径。
3.说出基因表达载体的构建的目的与组成。
[核心素养] 1.生命观念:
对基因工程的基本程序有整体的认知。
2.科学探究:
能复述PCR技术的原理和基本过程,了解扩增基因的方法。
一、目的基因的获取
1.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2.目的基因的获取
(1)目的基因:
主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)常用方法
①从基因文库中获取
a.基因文库:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。
b.种类
c.提取依据:
基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性。
②利用PCR技术扩增目的基因
a.PCR的含义:
是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
b.目的:
短时间内大量扩增目的基因。
c.原理:
DNA双链复制。
d.前提:
有一段已知目的基因的核苷酸序列。
e.过程
第一步:
加热至90~95℃,DNA解链为单链;
第二步:
冷却至55~60℃,引物结合到互补DNA链;
第三步:
加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
f.结果:
每一次循环后,目的基因的量可以增加一倍,即成指数形式扩增(约为2n,n为扩增循环的次数)。
③化学方法直接人工合成
a.条件:
基因比较小,核苷酸序列又已知。
b.方法:
借助DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
归纳总结 获取目的基因的方法比较
方法
从基因文库获取
PCR技术扩增
化学方法直接人工合成
基因组文库
部分基因文库(以cDNA文库为例)
过程
供体细胞中的总DNA
↓限制酶
许多DNA片段
↓连接
表达载体
↓导入
受体菌群
↓
外源DNA扩增,产生特定性状
↓分离
目的基因
目的基因的mRNA
↓反转录
单链DNA
↓合成
双链DNA
↓插入
载体
↓导入
受体菌群(cDNA 文库)
↓分离
目的基因
目的基因DNA
↓高温解链
单链DNA
与引物结
合、DNA
聚合酶
大量目的基因
蛋白质的氨基酸序列
↓推测
mRNA的核苷酸序列
↓推测
基因的核苷
酸序列
↓化学合成
目的基因
优点
操作简单
专一性强
可在短时间内大量扩增目的基因
专一性强,可产生自然界中不存在的新基因
缺点
工作量大、盲目性大、专一性差
操作过程较繁琐,技术要求高
需要严格控制温度,技术要求高
适用范围小
1.以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。
据图分析,下列说法正确的是( )
A.催化①过程的酶是RNA聚合酶
B.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C.催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶,都能耐高温
D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%,则一个双链DNA中,A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
[答案] B
[解析] 由题意可知,①②③④⑤分别表示反转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互补DNA链及互补链的合成,B正确;①过程由逆转录酶催化完成,A错误;催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶,过程⑤是在70~75℃的高温条件下进行的,只有该过程中的酶是热稳定DNA聚合酶,能耐高温,C错误;在DNA分子中有碱基T无U,D错误。
归纳总结 PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目
细胞内DNA复制
PCR技术
区别
解旋方式
解旋酶催化
DNA在高温下变性解旋
场所
主要在细胞核内
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶
解旋酶、DNA聚合酶等
热稳定DNA聚合酶
温度
细胞内温和条件
控制温度,需在不同温度下进行
结果
合成整个DNA分子
扩增特定的DNA片段或基因
联系
(1)模板:
均需要脱氧核苷酸双链作为模板
(2)原料:
均为四种脱氧核苷酸
(3)酶:
均需DNA聚合酶
(4)引物:
都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
2.下列有关获取目的基因的方法,叙述错误的是( )
A.从基因文库中直接获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性
B.由于真核细胞的基因中含有不表达的DNA片段,所以一般使用人工合成的方法获取真核细胞中的目的基因
C.如果基因比较小,核苷酸序列又已知,可以利用化学方法直接人工合成
D.PCR技术的原理是DNA复制,需DNA连接酶催化DNA合成
[答案] D
[解析] PCR技术的原理是DNA分子的复制,需要耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成,D错误。
科学探究 获取目的基因的方法选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列,可以通过构建基因文库的方法,即通过受体菌储存并扩增目的基因后,从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列,而且基因比较小,可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列,而且基因又比较大,可以通过PCR技术扩增目的基因。
二、基因表达载体的构建
1.基因表达载体构建的目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
易混辨析 复制原点≠启动子:
复制原点位于载体的开始端,驱动载体的自我复制,若复制原点被破坏,则重组载体将不能得以复制。
启动子则位于某基因的首端,负责驱动该基因的转录。
3.基因表达载体的构建过程
一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因,再用DNA连接酶把两者连接(如图)。
归纳总结 启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
化学
成分
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
mRNA上三个相邻碱基
位置
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
作用
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA
决定转录的结束
翻译的起始信号
决定翻译过程的结束
3.下列哪项不是基因表达载体的组成部分( )
A.启动子B.终止密码子
C.标记基因D.目的基因
[答案] B
[解析] 基因表达载体的组成为:
目的基因+启动子+终止子+标记基因等。
终止子位于基因的尾端,是一段有特殊结构的DNA短片段,可使转录在所需要的地方停止下来;终止密码子是mRNA上3个相邻的碱基,使翻译过程在相应的地方停止。
4.在基因工程的操作过程中,获得重组质粒不需要( )
①DNA连接酶 ②限制性核酸内切酶 ③RNA聚合酶
④具有标记基因的质粒 ⑤目的基因 ⑥四种脱氧核苷酸
A.③⑥B.②④C.①⑤D.①②④
[答案] A
[解析] 构建重组质粒时,首先要用限制性核酸内切酶切割含有目的基因的DNA片段和载体,其次需要用DNA连接酶将目的基因与载体连接;RNA聚合酶催化转录过程,获得重组质粒时不需要RNA聚合酶;获得重组质粒时,需要具有标记基因的质粒作为载体;重组质粒是由目的基因与质粒形成的;四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料,获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。
5.如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。
下列说法错误的是( )
A.图示过程是基因工程的核心步骤
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
[答案] B
[解析] 图示过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤;构建过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ;抗卡那霉素基因是标记基因,目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞;基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
科学思维 构建基因表达载体时限制酶的选择原因分析
(1)选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因:
选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端,可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。
(2)基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的原因:
①如果用一种限制酶切割,目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的,因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况,而符合要求的只有载体与目的基因的连接。
②如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载体以及目的基因与目的基因的自身连接,还能防止目的基因的反向连接,提高连接的有效性。
1.判断正误:
(1)所有的目的基因都可以从基因文库中直接获得( )
(2)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取( )
(3)标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来( )
(4)基因表达载体中有的含有启动子和密码子( )
(5)标记基因不一定是抗生素抗性基因( )
[答案]
(1)×
(2)× (3)√ (4)× (5)√
2.如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。
下列相关叙述中正确的是( )
A.三种方法都需要酶并均在体外进行
B.①②③碱基对的排列顺序均相同
C.三种方法均属于人工合成法
D.方法a不遵循中心法则
[答案] A
[解析] 这三种方法都是在体外进行的,且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶;方法b需要限制酶;方法c需要DNA聚合酶),A正确;通过方法a得到的目的基因不含有内含子,通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种,因此①②③碱基对的排列顺序不都相同,B错误;方法a和c属于人工合成法,而方法b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法,C错误;方法a遵循中心法则,D错误。
3.(2019·广东汕头潮南实验学校高二月考)某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性核酸内切酶的酶切位点如图所示,最好选用下列哪种质粒作为载体( )
[答案] D
[解析] 目的基因仅一侧含有限制酶NheⅠ的识别序列,用此酶切割不能获取目的基因,A项错误;目的基因两侧分别含有限制酶AluⅠ的识别序列,但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化,B项错误;目的基因两侧含有限制酶NheⅠ和AluⅠ的识别序列,但用这两种酶切割会产生不含目的基因的片段,C项错误;目的基因两侧分别含有限制酶NheⅠ和SmaⅠ的识别序列,用这两种酶切割会获取目的基因,而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接,D项正确。
4.下列有关抗虫基因表达载体的叙述,正确的是( )
A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶
B.抗虫基因表达载体中要有启动子和终止密码子
C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因,其作用是筛选含有目的基因的受体细胞
D.抗虫基因的表达启动于复制原点
[答案] C
[解析] 切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶,只要切割出的末端相同即可,A项错误;抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子,终止密码子位于mRNA上,B项错误;基因表达载体必须具备标记基因,其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来,C项正确;抗虫基因的表达开始于启动子,D项错误。
5.重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。
该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。
如图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。
其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中引物2、引物3)分别进行PCR扩增,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因。
结合所学知识,回答下列问题:
(1)引物中G+C的含量影响着引物与模板DNA结合的稳定性,引物中G+C的含量越高,结合稳定性。
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为。
(3)在引物1、引物2组成的反应系统中,经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过
次复制。
(4)若在引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均复制一次,共产生种双链DNA分子。
(5)若利用微生物扩增该目的基因,其基本步骤包括:
、、微生物的筛选和培养、从菌群中获取目的基因。
[答案]
(1)越高
(2)引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用 (3)2 (4)3 (5)目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞
[解析]
(1)由于C与G之间有3个氢键,而A与T之间有2个氢键,所以引物中C与G含量越高,引物与模板DNA的结合就越稳定。
(2)由题干可知,引物2和引物3具有互补配对片段,如果将引物2和引物3放在一个反应系统中,则会引起引物2和引物3的结合而失去作用。
(3)第一阶段形成的2个DNA分子分别含有引物1和引物2,图中第一阶段形成的DNA分子同时具有引物1和引物2,图示双链DNA分子至少要经过2次复制才能形成。
(4)两个反应系统中各自形成2种DNA分子,但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子,所以含有引物1和引物4的DNA属于同一种DNA,故共形成3种DNA分子。
(5)利用微生物扩增该目的基因的基本步骤为:
①将目的基因与载体结合;②将重组DNA导入受体细胞;③微生物的筛选和培养,④从菌群中获取目的基因。
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