人用狂犬病疫苗效价测定法nih法附疫苗vero 细胞+地鼠肾细胞技术资料.docx
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人用狂犬病疫苗效价测定法nih法附疫苗vero细胞+地鼠肾细胞技术资料
人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)
本法系将供试品免疫小鼠后,产生相应的抗体,通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。
试剂稀释液(PBS)量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml,混合后加水至5000ml,调pH值至7.2~8.0。
攻击毒株CVS制备启开毒种,稀释成10-2悬液,接种11~13g小鼠,不少于8只,每只脑内接种0.03ml,连续传2~3代,选择接种4~5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织,研磨后加入含2%马血清或小牛血清制成20%悬液,经每分钟1000转离心10分钟,取上清液经病毒滴定(用10只18~20g小鼠滴定)及无菌检查符合规定后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释参考疫苗用PBS稀释成1∶25、1∶125和1∶625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12~14g小鼠16只,每只小鼠腹腔注射0.5ml,间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天,用经预先测定的含5~100个LD50的病毒量进行脑内攻击,每只0.03ml。
同时将攻击毒稀释成100、10-1、10-2和10-3进行毒力滴定,每个稀释度均不少于8只小鼠。
小鼠攻击后逐日观察14天,并记录死亡情况,统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。
计算供试品和参考疫苗ED50值。
计算相对效力
P=T/S×dT/dS×D
式中P为供试品效价,IU/ml;
T为供试品ED50的倒数;
S为参考疫苗ED50的倒数;
dT为供试品的一次人用剂量,ml;
dS为参考疫苗的一次人用剂量,ml;
D为参考疫苗的效价,IU/ml。
【附注】
(1)动物免疫时应将疫苗保存在冰浴中。
(2)各组动物均应在同样条件下饲养。
(3)攻击毒原病毒液(100)注射的小鼠应80%以上死亡。
人用狂犬病疫苗(Vero细胞)
RenyongKuangquanbingYimiao(Vero Xibao)
RabiesVaccineforHumanUse(VeroCell)
本品系用狂犬病病毒固定毒接种Vero细胞,经培养、收获、浓缩病、病毒灭活、纯化后,加入适宜的稳定剂后制成,用于预防狂犬病。
1基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2制造
2.1生产用细胞
生产用细胞为Vero细胞。
2.1.1细胞的管理及检定
应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
各细胞种子批代次应不超过批准的限定代次。
取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管,经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。
2.1.2细胞制备
取工作细胞库中的1支或几支细胞管,细胞复苏、扩增至接种病毒的细胞为一批。
将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化,分散成均匀的细胞,加入适宜的培养液混合均匀,置37℃培养成均匀单层细胞。
2.2毒种
2.2.1名称及来源
生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V株、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
2.2.2种子批的建立
应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
各种子批代次应不超过批准的限定代次。
狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在Vero细胞上传代建立工作种子批传代次数应不超过35代,aGV株在Vero细胞上传代建立工作种子批传代次数应不超过15代。
2.2.3种子批的检定
主种子批应进行以下全面检定,工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1鉴别试验
用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。
将毒种作10倍系列稀释,取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合,同时设立正常血清对照组,试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只,每只脑内接种0.03ml,观察14天,中和指数应不低于500。
2.2.3.2病毒滴定
取毒种作10倍系列稀释,每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只,每只脑内接种0.03ml,观察14天,病毒滴度应不低于7.5LgLD50/ml。
2.2.3.3无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
2.2.3.4支原体检查
依法检查(附录XIIB),应符合规定。
2.2.3.5病毒外源因子检查
依法检查(附录XIIC),应符合规定。
2.2.3.6免疫原性检查
用主种子批毒种制备灭活疫苗,腹腔注射体重为12-14g小鼠,每只0.5ml。
7天后重复接种1次作为试验组,未经免疫小鼠做对照组。
第一次免疫后的第14天,试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击,每只0.03ml,每个稀释度10只小鼠。
保护指数应不低于100。
2.2.4毒种保存
毒种应置-60℃以下保存。
2.3原液
2.3.1细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2培养液
培养液为含适量灭能新生牛血清的MEM、199或其他适宜培养液。
新生牛血清的质量应符合规定(附录XIIID)。
2.3.3对照细胞外源因子检查
依法检查(附录XIIC),应符合规定。
2.3.4病毒接种和培养
当细胞培养成致密单层后,毒种按0.01-0.1MOI(同一工作种子批应按同一MOI接种)接种,置适宜温度下培养一定时间后,弃去培养液,用PBS冲洗去除牛血清,加入适量维持液,置33-35°C继续培养。
2.3.5病毒收获
经培养适当时间,收获病毒液。
根据细胞生长情况,可换以维持液进行多次病毒收获。
同一细胞批的同一次病毒收获液定合格后可合并为单次病毒收获物。
2.3.6单次病毒收获液检定
按3.1项进行。
2.3.7单次病毒收获液保存
于2-8°C保存不超过30天。
2.3.8单次病毒收获液合并、浓缩
同一细胞批生产的多个单次病毒收获液检定合格后可进行合并。
合并后的病毒液,经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围
2.3.9病毒灭活
于病毒收获液中按1:
4000的比例加入β—丙内酯,置适宜温度、在一定时间内灭活病毒,并于适宜的温度放置适宜的时间,以确保β-丙内酯完全水解。
病毒灭活到期后,每个灭活容器应立即取样,分别进行病毒灭活验证试验。
2.3.10纯化
灭活后的病毒液采用柱色谱或其他适宜的方法纯化,纯化后可加入适量人血白蛋白或其他适宜的稳定剂即为原液。
2.3.11原液检定
按3.2项进行。
2.4半成品
2.4.1配制
用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制,配制后总蛋白质含量应不高于80µg/剂,可加入适量硫柳汞作为防腐剂,即为半成品。
2.4.2半成品检定
按3.3项进行。
2.5成品
2.5.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.5.2分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定
2.5.3规格
每瓶1.0ml。
每1次人用剂量为1.0ml,狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU。
2.5.4包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3检定
3.1单次病毒收获液检定
3.1.1病毒滴定
按2.2.3.2项进行,病毒滴度应不低于6.0LgLD50/ml。
3.1.2无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.1.3支原体检查
依法检查(附录XIIB),应符合规定。
3.2原液检定
3.2.1病毒灭活验证试验
将病毒灭活后接种25ml供试品于Vero细胞上,每3cm2单层细胞接种1ml供试品,37℃吸附60分钟后加入细胞培养液,与供试品量比例不超过1:
3,每7天传1代,将培养21天后的培养液混合取样,分别进行动物法和酶联免疫法检测,动物法为脑内接种体重为11-13g小鼠20只,每只0.03ml,观察14天,应全部健存(3天内死亡的不计,动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%);采用酶联免疫法检查,应为阴性。
3.2.2蛋白质含量
取纯化后未加入人血白蛋白的供试品,依法测定,应不高于80μg/ml(附录VIB第二法)。
3.2.3抗原含量测定
采用酶联免疫法,应按批准的标准执行。
3.2.4无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.2半成品检定
无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.3成品检定
3.3.1鉴别试验
采用酶联免疫法检查,应证明含有狂犬病病毒抗原。
3.3.2外观
应为澄明液体无异物。
3.3.3装量
按附录IA装量项进行,应不低于标示量。
3.4.3化学检定
3.4.3.1pH值
应为7.2-8.0(附录VA)。
3.4.3.2硫柳汞含量
应不高于100ug/ml(附录VIIB)。
3.4.4效价测定
应不低于2.5IU/剂(附录XIA)。
3.4.5热稳定性试验
疫苗出厂前应进行热稳定性试验.于37℃放置14天后,按3.3.4项进行效价测定。
如合格,视为效价测定合格。
3.4.6无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定
3.4.7异常毒性检查
依法检查(附录XIIF),应符合规定。
3.4.8细菌内毒素检查
应不高于50EU/剂(附录XIIE凝胶限量试验)。
3.4.9牛血清白蛋白残留量
应不高于50ng/剂(附录VIIIF)。
3.4.10Vero细胞DNA残留量
应不高于100pg/剂(附录IXB)。
3.4.11Vero细胞宿主蛋白残留量测定
采用酶联免疫法测定,应不高于4ug/ml,并不得超过总蛋白质含量的5%。
3.4.12抗生素残留量检查
细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查,采用酶联免疫法,应不高于10ng/ml。
4保存、运输及有效期
于2-8℃避光保存和运输。
自生产之日起,按批准的执行。
5说明书
人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)
RenyongKuangquanbingYimiao(DishushenXibao)
RabiesVaccineForHumanUse(PHKCell)
本品系用狂犬病病毒固定毒接种原代地鼠肾细胞,经培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩、纯化,加入适宜的稳定剂后制成,用于预防狂犬病。
1基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2制造
2.1生产用细胞
生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。
2.1.1细胞管理及检定
应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.2细胞制备
选用12~14日龄地鼠,无菌取肾,剪碎,经胰蛋白酶消化,分散细胞,接种培养瓶,用适宜的培养液进行培养。
来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。
源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。
2.2毒种
2.2.1名称
生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或其他经地鼠细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
2.2.2种子批的建立
应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
原始种子批为2aG1,主种子批应不超过4aG。
毒种在地鼠肾原代细胞和豚鼠脑内交替传代制备工作种子批,在地鼠肾原代细胞的传代应不超过第6代,即不超过10aG;在豚鼠脑内传代应不超过第5代,即10aG5。
2.2.3种子批的检定
主种子批应进行以下全面检定,工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.5项检定。
2.2.3.1鉴别试验
用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。
将毒种作10倍系列稀释,取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合,同时设立正常血清对照组,试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只,每只脑内接种0.03ml,观察14天,中和指数应不低于500。
2.2.3.2病毒滴定
取毒种作10倍系列稀释,每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只,每只脑内接种0.03ml,观察14天,病毒滴度应不低于8.0LgLD50/ml。
2.2.3.3无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
2.2.3.4支原体检查
依法检查(附录XIIB),应符合规定。
2.2.3.5病毒外源因子检查
依法检查(附录XIIC),应符合规定。
2.2.3.6免疫原性检查
用主种子批毒种制备灭活疫苗,腹腔注射体重为12-14g小鼠,每只0.5ml。
7天后重复接种1次作为试验组,未经免疫小鼠做对照组。
第一次免疫后的第14天,试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击,每只0.03ml,每个稀释度10只小鼠。
保护指数应不低于100。
2.2.4毒种保存
冻干毒种应置-60℃以下保存。
2.3原液
2.3.1细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2培养液
培养液为含适量灭能新生牛血清的乳蛋白水解物、MEM、199或其他适宜培养液。
新生牛血清的质量应符合规定(附录XIIID)。
2.3.3对照细胞外源因子检查
依法检查(附录XIIC),应符合规定。
2.3.4病毒接种和培养
当细胞培养成致密单层后,毒种按0.01-0.1MOI接种(同一工作种子批应按同一MOI接种),置适宜温度下培养一定时间后,弃去培养液,用无菌PBS或其他适宜洗液冲洗去除牛血清,加入适量维持液,置33-35℃继续培养适当时间。
2.3.5病毒收获
经培养适宜时间收获病毒液,即为病毒单次收获液。
根据细胞生长情况,可换以维持液进行多次病毒收获。
同一细胞批的同一次病毒收获液经检定合格后可合并为单次病毒收获液;
2.3.6单次病毒收获液检定
按3.1项进行。
2.3.7单次病毒收获液保存
于2-8°C保存不超过30天。
2.3.8病毒灭活
病毒收获液中按1:
4000的比例加入甲醛溶液(应在规定的蛋白浓度范围内进行病毒灭活),置适宜温度、在一定时间内灭活病毒。
病毒灭活到期后,每个灭活容器应立即取样,分别进行病毒灭活验证试验。
2.3.9合并及超滤、浓缩
同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后可合并为一批,经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围。
2.3.10纯化
经浓缩后的病毒液采用柱色谱法或其他适宜的方法纯化。
纯化后可加入适量人血白蛋白作为稳定剂,即为原液。
2.3.11原液检定
按3.2项进行。
2.4半成品
2.4.1配制
用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制,总蛋白质含量应不高于80µg/剂,并加入适宜浓度的稳定剂和一定量的硫柳汞作为防腐剂,即为半成品。
2.4.2半成品检定
按3.3项进行。
2.5 成品
2.5.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.5.2分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.5.3规格
每瓶1.0ml。
每1次人用剂量为1.0ml,狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU。
2.5.4包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3检定
3.1单次病毒收获液的检定
3.1.1病毒滴定
按2.2.3.2项进行,病毒滴度应不低于5.5LgLD50/ml。
3.1.2无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.1.3支原体检查
依法检查(附录XIIB),应符合规定。
3.2原液检定
3.2.1无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.2.2病毒灭活验证试验
取病毒灭活后供试品经透析后,接种25ml于原代地鼠肾细胞或其他适宜敏感细胞,每3cm2单层细胞接种1ml供试品,37℃吸附60分钟后加入细胞培养液,与供试品量比例不超过1:
3,每7天传1代,将培养21天后的培养液混合取样,分别进行动物法和酶联免疫法检测。
动物法为脑内接种体重为11-13g小鼠20只,每只0.03ml,观察14天,应全部健存(3天内死亡的不计,动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%);采用酶联免疫法检查,应为阴性。
3.2.3蛋白质含量
取纯化后未加稳定剂的供试品,依法测定,应不高于80μg/剂(附录VIB第二法)。
3.2.4抗原含量
采用酶联免疫法,应按批准的标准执行。
3.3半成品检定
无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.4成品检定
3.4.1鉴别试验
采用ELISA法检查,应证明含有狂犬病病毒抗原。
3.4.2外观
应为无色澄明液体,无异物。
3.4.3装量
按附录IA装量项进行,应不低于标示量。
3.4.4化学检定
3.4.4.1pH值
应为7.2-8.0(附录VA)。
3.4.4.2硫柳汞含量
应不高于50ug/ml(附录VIIB)。
3.4.4.3游离甲醛含量
应不高于100ug/ml(附录VIL)。
3.4.4.4牛血清白蛋白残留量
应不高于50ng/剂(附录VIIIF)。
3.4.4.5地鼠肾细胞蛋白残留量测定
采用酶联免疫法,应不高于24ug/ml,并不得超过总蛋白质含量的30%。
3.4.5 效价测定
应不低于2.5IU/剂(附录XIA)。
3.4.6热稳定性试验
疫苗出厂前应进行热稳定性试验。
于37℃放置14天后,按3.4.5项进行效价测定。
如合格,视为效价测定合格。
3.4.6无菌检查
依法检查(附录XIIA),应符合规定。
3.4.7异常毒性检查
依法检查(附录XIIF),应符合规定。
3.4.8细菌内毒素检查
应不高于50EU/剂(附录XIIE凝胶限量试验)。
3.4.11抗生素残留量检查
细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查,采用酶联免疫法,应不高于10ng/ml。
4保存、运输及有效期
于2-8℃避光保存和运输。
自生产之日起,有效期为12个月。
5说明书
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