中国HIV1BED新发感染检测监测方案110330.docx
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中国HIV1BED新发感染检测监测方案110330
HIV-1新发感染血清学方法检测方案
(试行)
中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心
二〇一一年三月
前言
了解HIV-1新发感染率,对于预测疫情变化趋势、评估防治效果,具有非常重要的现实意义。
近几年,美国CDC发明了一种血清学方法(BED-EIA法),用于HIV-1新发感染检测。
与传统的队列方法比较,该捕获酶联免疫法简单,成本低廉,易于普及,比队列方法更加具有可操作性和实用性,可以在开展感染率监测的同时进行新发感染率监测。
美国CDC已于2005年将其纳入国家常规监测体系,全球数十个国家不同程度的将该方法应用于新发感染检测。
由于各国流行的HIV-1亚型及感染状况有所不同,UNAIDS建议各国首先进行研究和评价,获得当地的核心技术参数后再纳入应用。
中国CDC性病艾滋病预防控制中心,在国家十一五科技攻关重大项目和美国CDC的支持下,自2006年开始对BED方法,进行了系统研究与评价,获得在我国使用该方法的核心技术参数(新发感染窗口期及新发感染计算校正系数),建立了相应的质控体系,在并在16个省高危人群中开展了HIV-1新发感染检测的试点工作。
为进一步在全国更加规范、有效地开展HIV-1新发感染检测,在总结试点工作经验的基础上,经过全国HIV新发感染检测工作组多次讨论,广泛征求各级实验室、流行病和管理等人员意见和建议的基础上,历时数年,制定、完成了《HIV-1新发感染血清学方法检测方案》(以下简称《方案》)。
本《方案》共分十三部分,包括:
背景,目的,方法,范围及人群,操作流程,相关信息收集,检测样品入选,排除标准及相应要求,BED检测标准操作程序,数据分析,结果反馈,质量控制,数据使用和管理,任务分工。
本《方案》上报卫生部,经获准由中国疾病预防控制中心发至各省疾病预防控制中心及有关单位。
本《方案》将作为技术指导性文件,为各省开展HIV-1新发感染检测工作,提供强有力的支持。
本《方案》起草单位:
中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。
本《方案》参加编写单位:
云南省疾病预防控制中心、新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心、四川省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、江苏疾病预防控制中心、湖南省疾病预防控制中心、重庆疾病预防控制中心、广东省疾病预防控制中心、广西疾病预防控制中心、。
本《方案》编写组人员:
蒋岩、汪宁、肖瑶、沈圣、王璐、王岚、贾曼红、段松、倪明健、董永慧、秦光明、崔为国、潘晓红、郭志宏、卢红燕、还锡萍、陈曦、林华、林鹏、刘伟、邱茂峰胡红。
本《方案》主要国际技术顾问:
美国疾病预防控制中心GAP项目(MarcBulterys,BharatS.Parekh,OuChin-Yih)和世界卫生组织北京办(张岚)。
本《方案》编写工作联系人:
肖瑶。
本《方案》自发布之日起实施,《方案》解释权属于中国疾病预防控制中心。
HIV新发感染检测工作组
2011年3月3日
目录
1背景1
2目的2
3方法2
4范围及人群2
5操作流程2
6相关信息收集5
7检测样品入选、排除标准及相应要求5
8BED检测标准操作程序5
9数据分析8
10结果反馈9
11质量控制10
12数据使用和管理11
13任务分工11
参考文献13
附件1哨点监测HIV-1阳性样品BED检测送检单15
附件2哨点监测HIV-1阳性样品BED检测结果汇总表16
附件3病例报告新报告感染者样品BED检测结果汇总表17
附件4BED检测统计表18
附件5重点人群新发感染监测汇总分析表格19
1背景
近年来,随着实验室技术的发展,使得用血清学方法监测HIV-1新发感染成为可能[1]。
这些方法可以区分HIV-1新发感染和长期感染,获得国家/地区新发感染率。
目前,各国研究的血清学方法有十余种,其中经过系统评价、应用最广的是美国疾病预防控制中心建立的BEDHIV-1捕获酶联法(BED方法)。
该方法是通过测定HIV-1特异性IgG占总IgG抗体的比例,确定是否新发感染[2,3]。
因此对抗体水平(感染时间的长短)较敏感[4]。
在个体水平上由于抗体产生的差异,可能产生一定的假阳性和假阴性,但在人群水平上,假阳性数目与假阴性数目相近,可以相互抵消彼此的作用[2]。
该方法的应用,严格限制于人群新发感染率估计,结果不能反馈个体或其监护人及监管场所。
由于各亚型HIV-1新发感染的窗口期—即从标准酶联法检测抗体为阳性至预先设定的BED方法的标准化光密度值所需要的时间,略有不同,也为了更加有效地使用该方法,UNAIDS建议各国在使用之前进行评估,获得适宜的窗口期和校正系数[5]。
从2001到2005年,美国CDC先后举行了5次专家咨询会,监测、统计、实验室和传染病方面的专家研讨后确定了最佳方案,明确了窗口期(155天)和4个校正系数(α=0.7682,β=0.7231,γ=0.9443,ε=0.0557)。
自2005年开始,美国CDC将BED方法纳入国家艾滋病常规监测体系,全国需要进行新发感染检测的样品均寄至纽约州公共卫生实验室,统一检测,统一质控,统一数据处理。
2006年6月美国CDC发布了《资源有限国家BED检测/监测HIV-1新发感染指南》[6],为各国开展该领域工作提供了重要技术支持。
除美国外,法国、泰国、柬埔寨、赞比亚、乌干达、南非、卢旺达、肯尼亚、津巴布韦、科特迪瓦和埃塞俄比亚等国,也陆续将该方法用于HIV-1新发感染率监测[7-13]。
中国CDC性病艾滋病预防控制中心于2005年底开始,对该方法进行了系统评价,证明其具有较好的重复性和稳定性[14],与队列监测结果较为接近[15,16],干血斑样品也适用[17],研究获得适宜的窗口期为168天,4个校正系数为α=0.8098,β=0.7571,γ=0.9315,ε=0.0685[18]。
2005至2007年,在广东、广西、四川、重庆、新疆、贵州、云南和德宏启动了新发感染检测试点工作。
在试点地区建立了技术平台和质控体系,探讨了以IDU人群为主的新发感染检测/监测模式,积累了经验,也为试点地区了解HIV-1疫情提供了科学参考。
2008年试点工作扩大至15省(新增福建、河北、山东、上海、江苏、陕西、河南和北京)。
除IDU人群外,部分地区在MSM,暗娼、性病门诊、孕产妇和婚检人群中也陆续开始了新发感染检测[15,19-23]。
2006到2010年,性病艾滋病预防控制中心举行了多次专家咨询会及新发感染检测/监测工作组会议,讨论了在中国开展新发感染检测和监测方法。
监测、统计、实验室、临床和综合管理方面的专家,WHO、中美GAP、中默艾滋病及中盖艾滋病等项目的技术人员,共同研讨后确定了该方法在中国的使用方案。
2011年开始,拟将该方法扩大至全国大部分地区哨点重点人群和部分病例报告系统,进一步验证该方法的适用性和有效性。
为了有效开展新发感染检测工作,特制定本方案。
主要内容包括:
应用BED方法进行新发感染检测的目的,方法,范围及人群,操作流程,相关信息收集,检测样品入选及排除标准,BED标准操作程序,数据分析,结果反馈,质量控制,数据使用、管理,任务分工。
2目的
2.1了解重点人群HIV-1新发感染情况,为估计艾滋病流行形势和判断疫情变化提供科学依据。
2.2了解HIV-1新发感染在新发现感染者中的比例[24],探讨我国病例报告新发感染检测的适用性。
3方法
3.1样品和信息:
来源于哨点监测和病例报告系统;
3.2实验室检测:
使用BED方法;
3.3数据分析:
根据哨点重点人群监测新发现感染者样品的BED检测结果,结合流行病学相关资料,计算重点人群HIV-1新发感染率,并进行适当矫正;根据病例报告系统新报告感染者样品的BED检测结果,计算新发感染者占新报告感染者的比例,并根据相关背景信息,综合分析新发感染情况。
4范围及人群
4.1各省/自治区/直辖市每年监测哨点新报告的重点人群所有HIV-1感染者样品;
4.2各省/自治区/直辖市每年病例报告新发现的所有HIV-1感染者样品。
基本要求是覆盖第二季度新发现的所有感染者样品。
各省可以根据年度发现的感染者总量,决定进行BED检测的样品量,如第二季度总样品量太少,可以考虑覆盖更长时段,个别样品总量很少的地区,可以考虑覆盖全年。
5操作流程
各省新发感染检测集中在确证中心实验室进行。
各确证中心实验室检测结果须与国家参比室检测结果比对,复核后使用。
具体流程如下:
5.1哨点新报告重点人群感染者样品的新发感染检测流程(图一)
各哨点采集5ml血液样品,统一编号,连同问卷一并送至艾滋病检测实验室。
检测发现的阳性样品由确证实验室保存,分装(均分为两管,每管0.5ml),将两管样品与送检单(附件一)一并送至确证中心实验室。
确证中心实验室检查、复核全省哨点阳性样品,对符合BED检测标准的样品进行检测,并综合分析检测结果,计算HIV-1新发感染率。
各省确证中心实验室,须按照时间要求上报结果,上报内容包括:
BED数据处理表、重点人群HIV-1新发感染率和附件二。
参比室负责比对分析省确证中心实验室与参比室检测结果,分析、确认后将数据转交流病室,与哨点数据库对接,综合分析结果。
相关结果经新发感染检测/监测工作组会议讨论通过后,上报中国CDC和卫生部,同时反馈各省。
图一哨点新报告感染者样品的新发感染检测流程
5.2病例报告新发现感染者样品的新发感染检测流程(图二)
省确证中心实验室收集当年病例报告新发现感染者样品,对符合BED检测标准的样品进行检测,分析BED检测结果,计算HIV-1新发感染比例,即BED方法判断为新发感染的样品占进行检测的所有新发现感染者样品总数的比例。
按照时间要求将结果上报参比室,上报内容包括:
BED数据处理表、重点人群HIV-1新发感染比例和附件三。
参比室对检测结果及质控数据进行复核、确认后,将数据转流病室,与病例报告数据库对接,分析结果。
相关结果经新发感染检测工作组会议讨论通过后,上报中国CDC和卫生部,同时反馈各省。
图二病例报告新报告的感染者样品新发感染检测流程
5.3年度工作进度
每年新发感染检测/监测工作时间表:
5月试剂下发各省。
8月各省完成病例报告样品检测,上报检测结果;9月各省完成哨点阳性样品检测,同时将第二份样品及信息寄至国家参比室,并上报结果。
6相关信息收集
6.1哨点监测样品相关信息的收集
各省CDC负责收集哨点样品相关信息,包括哨点监测编号和病例报告系统卡片ID号(如果有)。
6.2病例报告系统样品相关信息的收集
通过与病例报告记录进行核对,了解是否有艾滋病相关症状、是否正在使用或曾经使用抗病毒治疗药物、既往是否做过HIV-1检测、第一次确证阳性时间以及是否进行CD4检测等,将明确已知的“长期感染”排除,并对可能的影响因素进行分析。
7检测样品入选、排除标准及相应要求
7.1入选标准
7.1.1新发感染检测必须应用诊断为HIV-1阳性的样品,禁止将HIV-1阴性样品纳入新发感染检测。
7.1.2每份样品量不少于1mL。
样品要求清亮、无严重溶血、没有交叉污染,必须保存在-20℃以下,反复冻融次数不多于三次。
7.2排除标准
7.2.1如果同一人在六个月以内出现两份或两份以上确认阳性样品,将第一份样品纳入新发感染检测,其余样品从总样品中删除。
7.2.2所有艾滋病病人样品。
7.2.3所有接受抗病毒治疗的HIV-1感染者样品。
7.3相应要求
7.3.1对于哨点样品,进行新发感染检测的样品量必须占应检测阳性样品的85%以上,否则不纳入新发感染检测。
7.3.2哨点样品必须具有哨点问卷编号,并尽可能补充病例报告系统卡片ID号。
病例报告样品应当填写病例报告系统卡片ID号。
8BED检测标准操作程序
8.1实验准备
8.1.1将主要试剂,包括稀释缓冲液(DiluentBuffer)、10×洗液(WashBuffer)、对照及样品分别从冰箱和冰柜中取出,平衡至室温待用。
8.1.21×浓度洗涤缓冲液(1×WashBuffer)的制备:
将100mL10×浓度的缓冲液与900mL的去离子水混合,用磁力搅拌棒混合至少10min。
未用的缓冲液在4℃可保存一周,之后后应丢弃。
8.2实验操作(初筛实验)
8.2.1根据板上的布局,在滴定管中将对照和样品分别稀释100倍:
吸取500μL稀释液DiluentBuffer到每个试管(多道或单道枪),按照初筛实验板子的布局(见图三),分别加入5μL对照或样品到相应的管中。
阴性对照稀释2份和余下的对照(CAL,LPC,HPC)稀释3份。
初筛实验时,每个的样品稀释一份。
确认实验时,每个样品稀释三份。
对照和校准品在使用完毕后必须迅速放回-20℃冰箱。
NC
HPC
6
14
22
30
38
46
54
62
70
78
NC
HPC
7
15
23
31
39
47
55
63
71
79
CAL
HPC
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
CAL
1
9
17
25
33
41
49
57
65
73
81
CAL
2
10
18
26
34
42
50
58
66
74
82
LPC
3
11
19
27
35
43
51
59
67
75
83
LPC
4
12
20
28
36
44
52
60
68
76
84
LPC
5
13
21
29
37
45
53
61
69
77
85
图三BED初筛实验板子布局图
8.2.2用多通道移液器小心地吹打稀释的对照和样品5次,然后吸取100μL移至微孔板中,将平板密封,37℃孵育1小时。
8.2.3孵育结束前的10分钟,将HIV-1生物素-抗原肽试剂用稀释缓冲液DiluentBuffer稀释1000倍。
用后放置在≤-20℃。
每个平板:
在12mL稀释缓冲液DiluentBuffer中加入12µLHIV-1生物素-抗原肽(用前涡旋混匀)。
涡旋充分搅匀混合。
部分平板:
对于每个8孔板条,在1mL稀释缓冲液DiluentBuffer中加入1µLHIV-1生物素-抗原肽。
涡旋充分搅匀混合。
8.2.4用96孔或带式洗板机,冲洗4次(冲洗2次然后将平板旋转后再冲洗2次),每孔300µL洗涤缓冲液1×WashBuffer,每次洗涤时浸泡10秒(若用带式洗板机,则设定程序时浸泡循环不是必需的)。
洗涤后,用吸水纸包裹平板,拍干残余的洗涤液。
8.2.5用多通道移液器在每孔中加入100µLHIV-1生物素-抗原肽,密封,37℃孵育1小时。
8.2.6洗板同步骤2.4。
8.2.7链亲和素-过氧化物酶结合物用稀释缓冲液DiluentBuffer稀释1000倍。
用后放置在≤-20℃;
每个平板:
涡旋含链亲和素-过氧化物酶(Streptavidin-HRP)的小瓶,在12mL稀释缓冲液中加入12µL链亲和素-过氧化物酶;充分涡旋混合。
部分平板:
对于每个板条(8孔),在1mL稀释缓冲液中加入1µL链亲和素-过氧化物酶;充分涡旋混合。
8.2.8用多通道移液器在每孔中加入100µL稀释的结合物,密封,37℃孵育90min。
8.2.9孵育期间,将TMB底物放置室温下。
8.2.10洗板同步骤2.4。
8.2.11确保TMB底物已达室温。
用多通道移液器在每孔中加入100µLTMB底物(不要密封),25℃下严格孵育15min进行显色。
8.2.12用多通道移液器在每孔中加入100µL终止液来终止反应。
8.2.13在荧光分光光度计上,用波长450nm(参考波长为630-650nm)进行读数。
8.2.14将OD值的文本文件保存在磁盘中,导入至Excelspreadsheet进行数据处理。
8.3实验结果
8.3.1确定对照和校准品的中值OD(中值OD为3次OD值排序后中间的值),对照和校准品的中值OD值必须在下表范围内,该试验才有效。
两个NC样品的OD值在初筛和确认中都必须在该范围内。
NC
CAL
LPC
HPC
最小值
0.000
0.500
0.200
0.900
最大值
0.250
1.200
0.800
2.200
8.3.2计算标准OD值(ODn)
对照的ODn值=对照的中值OD/校准品的中值OD
初筛中:
各样品的ODn值=各样品的OD值/校准品的中值OD
确认中:
各样品的ODn值=各样品的中值OD值/校准品的中值OD
8.3.3对照和校准品ODn值的可接受范围:
对照和校准品的ODn值必须在下表的范围内,该试验才有效。
NC
CAL
LPC
HPC
最小值
0.000
1.000
0.400
1.200
最大值
0.300
1.000
0.750
1.900
8.4确认实验
ODn值≤1.2时,分成三份重复检测,试验步骤同初筛步骤。
板子布局如图四所示。
NC
HPC
2
5
8
10
13
16
18
21
24
26
NC
HPC
3
5
8
11
13
16
19
21
24
27
CAL
HPC
3
6
8
11
14
16
19
22
24
27
CAL
1
3
6
9
11
14
17
19
22
25
27
CAL
1
4
6
9
12
14
17
20
22
25
28
LPC
1
4
7
9
12
15
17
20
23
25
28
LPC
2
4
7
10
12
15
18
20
23
26
28
LPC
2
5
7
10
13
15
18
21
23
26
BL*
*BL=空白
图四BED确认实验板子布局图
8.5结果的解释
在中国的研究表明,BED的ODn为0.8时,可以指明平均血清阳转时间为168天。
ODn为0.8时可以减少AIDS病人错分为近期感染的几率,进而得到较好的近期感染的预测值。
在初筛中样品为单份检测,其ODn值≤1.2时,分成三份重复检测。
在确认试验中,若ODn值≤0.8时,该份样品认为是近期感染。
BED检测的流程见图五。
图五BED检测流程图
9数据分析
9.1HIV-1新发感染率的计算
监测哨点HIV-1新发感染率是指:
各省哨点监测重点人群中,每年新感染HIV-1人群占暴露人群的比例。
新发感染率的计算,原则上以省为单位计算各重点人群新发感染率。
当样品量足够多时,也可以考虑按照地区计算新发感染率。
也可以按照设定的因素对HIV-1新发感染率监测数据进行分层分析,如年龄、性别、感染途径、婚姻状况、行为因素、受教育程度等,可得到地区水平上的分层数据。
将新发感染检测数据汇总后(参考附件4格式),即可进行类似分析。
新发感染率有McDougal和Hargrove两种计算法(在中国推荐优先使用McDougal计算法),每种方法均有中点公式和回顾公式。
回顾公式是对在横断面抽样前一年的新发感染率估计,中点公式是对在横断面抽样约+/-6个月时的新发感染率估计。
(1)McDougal法(调整灵敏度/特异度)
中点公式:
回顾公式:
校正因子F:
(2)Hargrove法(调整特异度)
中点公式:
回顾公式:
变量符号:
①待计算的变量值:
I=新发感染率(高危人群中每100人年新感染的数量),F=调整灵敏度或特异度的调整因子;②在横断面调查中测量的变量值:
T=调查的总人数,P=HIV-1检测为阳性的总人数,N=HIV-1检测为阴性的总人数,R=BED检测为新近感染的总人数;③从单独的校准研究中获得的变量值:
w=窗口期(从血清阳转到BED方法能够判为新发感染的最长时间),α=BED检测新发感染(<1w)的灵敏度,β=BED方法对感染时间在1w-2w天样品的特异度,γ=BED方法对感染时间超过2w天样品的特异度,ε=BED方法对感染时间超过2w天样品的误判率。
我国BED方法HIV-1新发感染相关的校正系数值是基于分析来自1565个已知血清阳转日期(大约)样品的BED检测值,这些值为:
w=168天,α=0.8098,β=0.7571,γ=0.9315,ε=0.0685。
9.2HIV-1新发感染比例的计算
病例报告新发感染比例是指:
(以第二季度样品为例)
各省每年第二季度新发现的感染者中,被BED识别为新近感染的感染者占所有进行BED检测的感染者的比例。
病例报告新发感染比例=(第二季度新发现的感染者中被BED判定为新近感染的感染者数/进行BED检测的第二季度新发现的感染者总数)×100%。
10结果反馈
中国CDC性艾中心新发感染检测/监测工作组,根据实验室检测结果,结合流行病学资料和病史,进行综合分析、校正后,计算新发感染率,与各省分析讨论后将最终数据反馈各省/自治区/直辖市CDC,同时上报中国CDC和卫生部。
11质量控制
11.1哨点监测现场质量控制
各省CDC指导各监测哨点按照“全国艾滋病监测方案”要求,对现场进行的抽样、问卷调查和采血进行质量控制。
确保哨点将样品和信息齐全的问卷表同时送至艾滋病检测实验室。
11.2样品质控
11.2.1所有哨点样品的采集、运输、检测及保存必须严格按照“全国艾滋病检测技术规范”执行。
样品采集时间按照监测工作要求执行。
11.2.2所有哨点新报告的HIV阳性样品,保存在-20℃以下,按照要求,由确证中心实验室统一寄至参比室。
严格检查每一份样品,确保样品连同哨点监测号(12位),一并送达。
11.2.3所有第二季度新报告的感染者样品,统一保存在省确证中心实验室,参比室不定期抽查,并在现场进行检测。
11.3试剂质控
11.3.1BED试剂由性艾中心统一采购,每批试剂有参比室进行平行试验验证,确保符合质量要求之后,提供给各省确证中心实验室。
11.3.2试剂必须采取冷链运输。
11.3.3各实验室使用的检测试剂必须按照要求保存(分别放置在4℃和-20℃冰箱)。
11.3.4试剂必须在有效期内使用。
11.3.5各批次试剂盒成分不得混合使用。
11.4实验质控
11.4.1直接进行新发感染检测/监测的技术人员必须接受国家级培训,获得证书。
11.4.2每个参加实验室必须建立SOP文件和QA/QC计划。
11.4.3酶标仪和加样器须在校准有效期内。
11.4.4每次试验必须通过试剂质控和室内质控。
室内质控品由国家参比室统一提供。
11.4.5任何一次检测出现无效实验,均需进行重复检测。
11.4.6保留所有的原始实验记录,并有检测人以及复核人的签字。
11.4.7实验偏倚的处理及注意事项:
一旦实验结果发生偏倚,要仔细检查试剂和质控品有效期以及贮存温度;核对洗液的配制浓度;检查酶标仪、洗板机及加样器的校准期;严格按照说明书控制孵育温度和时间。
所有上述事项核对无误后,重新进行实验。
1
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