月季组织培养的污染控制.docx
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月季组织培养的污染控制
目录
摘要2
关键词2
1材料与方法3
1.1药品3
1.2实验器材、器皿4
1.3材料4
1.4实验步骤4
1.4.1培养基的配置4
1.4.2材料的准备4
1.4.3接种5
1.4.4培养5
1.5数据统计5
2结果与分析5
2.1次氯酸钠处理对外植体污染率和发芽率的影响6
2.2升汞对外植体污染率和发芽率的影响6
2.3两种不同灭菌试剂对外植体污染率和发芽率影响的比较7
3结论8
4讨论8
4.1污染的控制8
4.2死亡率的控制9
4.3褐化的控制9
参考文献10
致谢10
月季组织培养的污染控制
摘要:
实验选用升汞(0.1%)10min、15min、20min和次氯酸钠(0.2%)5min、10min、15min两种药物不同处理时间进行对比实验,以筛选出既能得到较好的消毒效果又有较高萌芽率的处理方式。
结果表明:
采用升汞(0.1%)消毒15min的消毒效果最好,萌芽率72.43%,褐化率4.37%,死亡率2.49%。
关键词:
月季;组织培养;污染
Abstract:
Usemercuricchloride(0.1%)for10min,15min,20minandsodiumhypochlorite(0.2%)for5min,10min,15minforpollutioncontrolexperiment.Theresultsshowed:
Usedmercuricchloride(0.1%)disinfection15ministhesuitablemethodtocontrolpollution,germinationrateis72.43%,browningrateis4.37%,mortalityis2.49%.
Keywords:
RosaChinensis,tissueculture,pollution
月季(RosaChinensis)蔷薇科蔷薇属木本植物,又名月月红、长春花、四季蔷薇[1]。
源于中国又盛行于中国。
常绿或半常绿,灌木或藤本。
枝梢开张,有倒钩皮刺。
叶互生,奇数羽状复叶,小叶3~5枚。
花单生或数朵排列成伞房花序,花瓣5枚或重瓣,有香味,花色丰富,有白、黄、橙、粉、红、紫、蓝、复色等。
果卵形或倒卵形,红色。
月季也是国际流行切花,在国内是50余个城市的市花,也是欧美一些国家的国花[2]。
可以说,在世界范围内,月季是用来表达人们关爱与友谊、欢庆与祝贺的最通用的语言[3]。
近年自育品种已逐渐增多,但人们日益增长的物质文化需要就更加对品种的要求非常高,所以传统的繁育体系已经不能适应月季发展的需要了,因此植物组织培养的出现给月季品种的更新和改良提供了可靠的保证。
90年代发展起来的以组织培养为基础的转基因技术为月季育种提供了一条新途径。
这种方法不但使品种在外源基因所控制的性状上发生改变,其性状保持相对稳定,还可利用其他生物类型的基因,创造更加优良的品种。
但在组织培养中污染的危害是一个严重的问题,在工厂化生产中只要解决污染问题,实现工厂化快速繁殖将会大幅度降低生产成本,同时解决污染问题更有利培育出更好的新品种,以满足人们日益增长的物质生活需要,在花卉行业竞争中占有较大市场空间[4]。
植物组织培养技术仍然存在不少问题,其中污染、褐化、玻璃化被认为是组织培养的三大杀手。
与褐化、玻璃化相比污染更易发生,给科研和生产实践带来巨大的危害。
因此采取有效的防控措施,降低污染发生的机率,是组织培养成功的重要保障。
污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败的现象。
污染的原因,主要是外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等[5]。
在污染的原因中,外植体的污染是最严重的,所以要搞好组织培养就要做好外植体的灭菌。
污染的预防措施有
(1)用茎尖作外植体,可以在室内或无菌的条件下对枝条预培养。
(2)避免阴雨天在田间取外植体,在晴天采取时,下午采取的外植体要比早晨采取的污染少。
(3)目前对材料和材料的内部污染还没有令人满意的灭菌方法。
做好灭菌技术就有利于提高月季的组织培养的成功率,加速组织培养育苗的产业化[6]。
组织培养有利于月季的快速繁殖、脱毒、体细胞无性系和新品种培育、单倍体育种、遗传转化、还有人工种子和有用物质的生产等[7]。
1材料与方法
1.1药品
升汞0.1%次氯酸钠0.2%乙醇75%6BA琼脂培养基母液
1.2实验器材、器皿
超净工作台电子天平高压灭菌锅微波炉接种刀烧杯三角瓶培养皿平底试管
1.3材料
华西亚高山植物园的月季当年生中部枝条
1.4实验步骤
1.4.1培养基的配置
称琼脂7.5g→蒸馏水400~500ml→微波加热10min,蔗糖30g→母液→定容至1L→调pH5.8~6.0→分装→高温灭菌
1.4.2材料的准备
1.4.2.1外植体的采集
在晴天早晨采集生长健壮无病虫发育正常的月季的当年生枝条。
1.4.2.2外植体的消毒
表1 外植体灭菌处理方法表
药品名称灭菌时间(min)
5
次氯酸钠(0.2%)10
15
10
升汞(0.1%)15
20
采回的枝条去除叶、刺、上部(枝条上端含有两个侧芽的部分)和下部(枝条下端含有两个侧芽的部分),剪成2cm~3cm长(带有一个侧芽)[8]。
清水冲洗5min,再洗衣粉水漂洗30min,再清水冲洗30min。
经过预处理的外植体在超净台上进行消毒处理。
75%乙醇消毒30s,无菌水冲洗3次。
再进行升汞和次氯酸钠处理,处理方法见表1
1.4.3接种
把经过表面灭菌后的带侧芽茎段从新切割上下两端的和药物直接接触的部分,接种到无菌培养基上。
1.4.4培养
接种后的外植体置培养室内进行培养。
培养温度25±1℃,光照强度1250Lx,光照时间12h/d,培养期30d。
1.5数据统计
培养期结束后,对外植体发芽率、污染率、死亡率、褐化率进行统计
污染率(%)=污染的外植体数/接种外植体总数×100
死亡率(%)=死亡的外植体数/接种外植体总数×100
褐化率(%)=褐化的外植体数/接种外植体总数×100
发芽率(%)=发生芽的外植体数/无菌外植体总数×100
2结果与分析
表2 次氯酸钠与升汞灭菌处理效果统计表
药品名称灭菌时间发芽率污染率褐化率死亡率
(min)(%)(%)(%)(%)
535.4246.589.328.68
次氯酸钠1059.6531.351.688.32
(0.2%)1547.4123.596.4722.53
1038.1241.7812.367.64
升汞1572.3420.804.372.49
(0.1%)2050.4716.8717.1315.53
培养1~2d发现细菌的污染,3~10d出现真菌的污染。
培养一周后,芽开始萌动,在培养期结束进行结果统计。
统计结果见表2
2.1次氯酸钠处理对外植体污染率和发芽率的影响
用0.2%次氯酸钠对外植体处理不同时间时,它的发芽率、污染率、褐化率、死亡率都有显著差异。
本实验中污染率最低为23.59%,其灭菌时间为15min。
最高达46.58%,其灭菌时间为5min。
说明采用0.2%次氯酸钠灭菌时,随着灭菌时间的延长,污染率会降低。
这是因为灭菌时间越长对外植体灭菌越彻底。
对于最适灭菌时间的筛选,不仅要选择最低污染率,还要看其发芽率。
从表2中可以看出发芽率最高达59.65%,灭菌时间为10min,灭菌15min的发芽率只有47.41%。
这可能是灭菌时间过长会降低发芽率。
灭菌时间过长会伤害外植体细胞的分生能力,从而降低发芽率。
同时灭菌时间的长短也会影响褐化率,本实验中灭菌时间为10min,褐化率最低为1.68%,死亡率为8.32%;灭菌15min时,褐化率为6.47%,死亡率最高达22.53%。
这说明随着灭菌时间的越长,对外植体伤害越大,褐化率和死亡率都会升高。
选择最适的灭菌时间就要根据发芽率,污染率、褐化率、死亡率综合选择,试验表明用次氯酸钠对外植体处理最佳时间为10min(见图1)。
图1 次氯酸钠灭菌处理效果分析图
2.2升汞对外植体污染率和发芽率的影响
采用0.1%升汞对外植体处理不同时间时,它的发芽率、污染率、褐化率、死亡率都有明显不同,见图2。
本实验中灭菌时间为20min污染率最低为16.87%,灭菌时间为10min污染率最高达41.78%。
说明采用0.1%升汞灭菌时,随着灭菌时间的延长,污染率会降低。
这是因为灭菌时间越长对外植体灭菌越彻底。
对于最适灭菌时间的筛选,不仅要选择最低污染率,还要看其发芽率。
从表2中可以看出灭菌15min发芽率最高达72.34%,而灭菌时间为10min时,发芽率只有38.12%,灭菌20min的发芽率也只有50.47%。
这可能是灭菌时间过长或过短都会降低发芽率,灭菌时间过长会伤害外植体细胞的分生能力,从而降低发芽率,灭菌时间过短,又会因为灭菌不彻底而降低发芽率。
同时灭菌时间的长短也会影响褐化率,本实验中灭菌15min褐化率最低为4.37%,灭菌时间越长,对外植体伤害越大,死亡率越高,实验中灭菌20min死亡率最高达15.53%。
选择最适的灭菌时间就要选择最高发芽率,最低污染率、褐化率、死亡率,综合选择,因此用0.1%升汞对外植体处理最佳时间为15min。
图2 升汞灭菌处理效果分析图
2.3两种不同灭菌试剂对外植体污染率和发芽率影响的比较
因为不同灭菌试剂各有最佳的灭菌时间,所以要选择次氯酸钠和升汞的最佳灭菌效果进行比较,即0.2%次氯酸钠10min与0.1%升汞15min比较,见图3。
0.2%次氯酸钠10min比0.1%升汞15min的污染率高10.55%,可能是次氯酸钠10min比升汞15min的灭菌更彻底,灭菌效果更好。
次氯酸钠10min比升汞15min的发芽率低12.69%,死亡率高5.83%。
这是由于次氯酸钠比升汞灭菌时对外植体的伤害大,次氯酸钠是一种强氧化剂,有很强的杀菌效力,世界卫生组织确认其是一种高效强力广谱杀菌剂。
次氯酸钠消毒液能迅速杀灭各种致病菌和病毒[9],选择最适的灭菌试剂就要选择最高发芽率,最低污染率、褐化率、死亡率。
综合选择,外植体处理最佳处理方法为0.1%升汞处理15min。
图3 次氯酸钠与升汞灭菌效果对比图
3结论
3.1采用次氯酸钠(0.2%)灭菌时,消毒时间为10min的消毒效果较好。
萌芽率59.65%、污染率31.35%、死亡率1.68%、褐化率8.32%。
3.2采用升汞(0.1%)灭菌时,消毒时间为15min的消毒效果较好。
萌芽率72.34%、污染率20.80%、死亡率4.37%、褐化率2.49%。
3.3通过两种药剂的灭菌效果的比较可得,月季组织培养中最好的灭菌方法是采用升汞(0.1%)灭菌15min。
4讨论
4.1污染的控制
利用不同时间的升汞、次氯酸钠进行严格的消毒,能较好地控制因外植体自身带菌所致的污染。
本次实验的污染率控制到16.87%,但从整体上来看污染率还是很高,最高达46.58%。
还需要进一步降低污染率,还可以通过选择良好的无菌环境和严格的操作来控制污染;不同浓度的灭菌试剂也可以降低污染率;目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。
在菌类长入组织内部时,可以通过除去韧皮组织,只接种内部的分生组织,会收到一定的效果,但在这方面还有待进一步研究[10]。
4.2死亡率的控制
本次实验死亡率最低控制在2.49%,最高达15.53%。
从统计结果来看采用次氯酸钠比采用升汞灭菌的死亡率要高。
所以选用较温和的灭菌剂。
选择最适灭菌时间,可以降低污染。
还可通过培养基的,选择降低药剂的浓度。
选用外植体的其它部位,最好的生长季节。
来控制死亡率。
4.3褐化的控制
褐化的控制,本实验选择不同试剂,不同时间来控制褐化,最低选褐化率为1.68%。
最高褐化率为22.53%。
整体效果还是比较好,还可以通过选取适当的外植体并建立最佳的培养条件来防止褐化。
选用一年生健康的植株,这样的外植体有较强的分生能力,使其处于旺盛的生长状态,减少褐化。
对于易褐变的材料进行连续转移可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用,同时还可以加抗氧化剂和活性炭。
参考文献
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中国林业出版社,1991:
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