叶用银杏种质资源黄酮和萜内酯类含量及AFLP遗传多样性分析.docx
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叶用银杏种质资源黄酮和萜内酯类含量及AFLP遗传多样性分析
园艺学报,():
–2014411223732382http:
//www.ahs.ac.cn
ActaHorticulturaeSinica
E-mail:
yuanyixuebao@
收稿日期:
2014–08–05;修回日期:
2014–10–17
基金项目:
国家科技支撑计划项目(2012BAD21B04);山东省农业良种工程重大课题(鲁农良字[2011]7号);国家植物种质资源共享
平台项目(2013-39)
叶用银杏种质资源黄酮和萜内酯类含量及
AFLP遗传多样性分析
吴岐奎,邢世岩*,王萱,孙立民
(山东农业大学林学院,山东泰安271018)
摘要:
对叶用银杏种质资源进行黄酮和萜内酯类含量及AFLP遗传关系分析。
结果表明,叶用银杏
种质资源在黄酮和萜内酯类含量水平和DNA分子水平上都存在较高的遗传多样性。
68份叶用银杏种质叶
片提取物成分中银杏苦内酯A、B、C、J和白果内酯B,银杏总内酯,黄酮的平均含量分别为0.0371%、
0.0185%、0.0280%、0.0133%、0.0243%、0.1216%、1.7103%。
8对AFLP引物组合共扩增出1408条谱带,
其中多态带为99.28%,Nei’s基因多样性和Shannon’s指数分别为0.1939和0.3142;种质间的遗传相似系
数在0.2924~0.7413之间,平均值为0.4888。
种质间基于黄酮和萜内酯类含量分析的聚类分析结果与基
于遗传相似系数的UPGMA聚类分析结果基本一致。
利用黄酮和萜内酯类含量和AFLP分析相结合的方
法,筛选出高黄酮和萜内酯类特异种质,对叶用银杏种质资源的评价与保护有一定的积极意义。
关键词:
银杏;种质资源;叶用;黄酮;萜内酯类;含量;AFLP;遗传多样性
中图分类号:
S792.95文献标志码:
A文章编号:
0513-353X(2014)12-2373-10
GeneticDiversityofLeaf-used
Ginkgobiloba
GermplasmsBasedon
FlavonoidsandGinkgolidesContentsandAFLPMarkers
WUQi-kui,XINGShi-yan*,WANGXuan,andSUNLi-min
(
CollegeofForestry
,
ShandongAgriculturalUniversity
,
Tai’an
,
Shandong
271018,
China
)
Abstract:
Thegeneticrelationshipofleaf-used
Ginkgo
biloba
L.germplasmswereevaluatedby
flavonoidsandginkgolidescontentsandAFLPmarkers.Theresultsshowedthatrichgeneticdiversity
existedinbothflavonoidsandginkgolidescontentsandAFLPmarkers.Theaveragecontentofleaf
extracts(Ga,Gb,Gc,Gj,Bb,Te,GF)in68leaf-used
G.
biloba
L.germplasmsare0.0371%,0.0185%,
0.0280%,0.0133%,0.0243%,0.1216%and1.7103%respectively.Amongthe1408bandsobtainedfrom
8selectiveprimerpairs,99.28%ofthemwerepolymorphic.Nei’sgeneticdiversitywas0.1939,and
Shannon’sindexwas0.3142.Themoleculargeneticsimilaritycoefficientsrangefrom0.2924to0.7413,
withanaverageof0.4888.Theresultsofhierarchicalclusteranalysisbasedtheflavonoidsandginkgolides
contentsofdifferentpopulationsandUPGMAexhibitedagoodconsistency.Bythehybridmethodof
flavonoidsandginkgolidescontentsandAFLPmarkersanalysis,screenoutthedistinctive
G.
biloba
germplasmsofhigh-flavonoidsandginkgolides,wouldbevaluableforgermplasmmanagementand
*通信作者Authorforcorrespondence(E-mail:
xingsy@)
2374园艺学报41卷
utilizationofleaf-used
G.
biloba
L.germplasm.
Keywords:
Ginkgo
biloba
;germplasm;leaf-used;flavonoids;ginkgolides;content;AFLP;
geneticdiversity
银杏(
Ginkgobiloba
L.)是银杏科单属种植物,是第四纪冰川之后唯一保存下来的孑遗植物。
银杏果、叶、材等用途广泛,具有较高的经济效益、生态效益和社会效益(邢世岩,2013)。
自1965
年德国的Schwabe首次将银杏叶提取物(
Ginkgobiloba
extract,EGb)引入医学实践后,叶用银杏
的栽培、生理活性物质的提取和加工等一系列的研究逐步开展,目前法国、德国、新西兰、美国等
对叶用银杏药物成分的研究处于领先水平(Dipaketal.,2014)。
叶用银杏以叶大、高产、优质为主
要选种目标,优先选择叶内有效成分含量高的种质。
中国是银杏资源的起源、进化及分布中心,拥
有大量的银杏资源,积极开展叶用银杏种质资源研究具有重要意义(邢世岩,1997)。
近年银杏成为药用研究开发的热点植物之一,其生理活性物质的含量水平是评价银杏药物制剂
最常用的指标(DelTredici,1991)。
目前从银杏叶片中分离出来的成分较为复杂,主要有黄酮类、
萜内酯类、聚戊烯醇等化合物,此外还有酚类、生物碱、有机酸、碳水化合物和矿质元素等药用成
分(史清文等,1995)。
有关银杏叶提取物的研究大多集中在其主要成分的生理生化水平(陈佳等,
2010;Chenetal.,2012)及药用效果(Sandraetal.,2010;Zhouetal.,2011)方面。
黄酮类和萜
内酯类化合物(银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、银杏苦内酯J、白果内酯B)是其中
最主要的两大类生理活性物质,具有改善血液循环抑制血栓形成、拮抗支气管收缩、改善脑细胞代
谢水平及清除自由基等多种作用(Wangetal.,2006a;Giedreetal.,2010)。
分子标记技术在银杏种质遗传多样性(Tsumura&Ohaba,1997;王利等,2009;Singhetal.,
2010)、遗传图谱的构建(刘叔倩等,2001)、银杏雌雄性别鉴定(Liaoetal.,2009)、银杏遗传变
异和特异种质分析(Fanetal.,2004;Shenetal.,2005)等方面有较多的研究报道。
AFLP标记是
目前较为常用的分子标记方法,综合了RFLP和RAPD技术的优点,已用于观赏银杏(Wangetal.,
2006b)、雄株银杏(郭彦彦,2006)、雌株银杏(王利等,2008)等研究,但针对于叶用银杏种质
资源遗传多样性和特异种质分析的研究报道较少。
本研究中采用银杏叶黄酮和萜内酯类含量分析与AFLP遗传多样性分析相结合的方法,筛选出
黄酮和萜内酯类含量较高、遗传特异性较强的叶用银杏种质,为叶用银杏种质资源的开发、利用及
特异种质的鉴定、保护提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
68份叶用银杏种质资源材料(表1)来自山东农业大学银杏种质资源苗圃。
于2013年4月,
每份材料采集幼嫩叶片3~4片,硅胶干燥保存备用,用于DNA的提取。
于2013年8月,每份材
料采集成熟叶片10片,用于叶片黄酮和萜内酯类含量测定。
1.2叶片黄酮和萜内酯类含量测定
银杏叶片提取物中的主要测定成分包括:
银杏苦内酯A(Ga)、银杏苦内酯B(Gb)、银杏苦内
酯C(Gc)、银杏苦内酯J(Gj)、白果内酯B(Bb)、银杏萜内酯(Te)和黄酮(GF)。
黄酮含量采用Rutin分光光度法(邢世岩等,1998)测定。
按GF(%,干样)=Rutin(g·L-1)/
样品质量(g)×稀释倍数×10-3×100计算。
12期吴岐奎等:
叶用银杏种质资源黄酮和萜内酯类含量及AFLP遗传多样性分析2375
萜内酯类含量采用HPLC国际标准(vanBeeketal.,1990)测定。
色谱条件:
仪器岛津(Shimadzu)
LC-10ADHPLC,视差折光检测器(RP-HPLCRI),色谱柱C18(Shimadzu),柱箱CTO-10A,柱温
36℃,流动相为甲醇(CH3OH)︰水(H2O)=1︰3,流速0.8~1.0mL·min-1。
银杏叶萜内酯类组
分含量及总量按下式计算:
银杏萜内酯(%)=A酯/A标×100/R×1.045/M。
其中,R为内酯的响应
因子(RGa=1.12,RGb=1.16,RGc=1.26,RGj=1.21,RBb=1.11);M为叶片样品质量(mg);A酯为
萜内酯类组分的峰面积,A标为内标峰面积。
根据银杏叶各萜内酯含量计算内酯总量,银杏叶内酯总量(Te,%)=Ga(%)+Gb(%)+Gc
(%)+Gj(%)+Bb(%)=ΣGi(%)+Bb(%)。
表1叶用银杏种质来源、代号及性别
Table1Plantgeographicalorigin,coedandsexualityofleaf-used
G
.
biloba
germplasm
来源
Origin
代号
Accession
性别
Sexuality
来源
Origin
代号
Accession
性别
Sexuality
安徽宁国Ningguo,AnhuiY1雌Female山东泰安Tai’an,ShandongY35雌Female
Y2雄MaleY36雌Female
Y3雌FemaleY37雌Female
福建芦山Lushan,FujianY4雄MaleY38雌Female
福建尤溪Youxi,FujianY5雌FemaleY39雌Female
广西桂林Guilin,GuangxiY6雄MaleY40雌Female
贵州印江Yinjiang,GuizhouY7雄Male山东郯城Tancheng,ShandongY41雄Male
Y8雌FemaleY42雄Male
Y9雌FemaleY43雄Male
湖北安陆Anlu,HubeiY10雄MaleY44雄Male
湖南东安Dong’an,HunanY11雄MaleY45雄Male
Y12雌FemaleY46雄Male
江苏泰兴Taixing,JiangsuY13雌FemaleY47雌Female
江西信丰Xinfeng,JiangxiY14雌FemaleY48雌Female
山东海阳Haiyang,ShandongY15雄MaleY49雌Female
Y16雌FemaleY50雌Female
Y17雌Female山东枣庄Zaozhuang,ShandongY51雌Female
Y18雌Female陕西延安Yanan,ShaanxiY52雌Female
山东济宁Jining,ShandongY19雌Female陕西杨陵Yangling,ShaanxiY53雌Female
山东蒙阴Mengyin,ShandongY20雄Male陕西长安Chang’an,ShaanxiY54雄Male
Y21雌Female陕西周至Zhouzhi,ShaanxiY55雄Male
山东青岛Qingdao,ShandongY22雌Female四川万源Wanyuan,SichuanY56雌Female
山东日照Rizhao,ShandongY23雄MaleY57雌Female
Y24雄Male云南腾冲Tengchong,YunnanY58雄Male
Y25雌FemaleY59雌Female
Y26雌FemaleY60雌Female
山东荣城Rongcheng,ShandongY27雄Male浙江富阳Fuyang,ZhejiangY61雌Female
Y28雌Female浙江丽水Lishui,ZheijiangY62雄Male
Y29雌FemaleY63雄Male
山东泰安Tai’an,ShandongY30雄Male浙江诸暨Zhuji,ZhejiangY64雌Female
Y31雄MaleY65雌Female
Y32雄MaleY66雌Female
Y33雄MaleY67雌Female
Y34雌FemaleY68雌Female
1.3AFLP分析
用改良CTAB法(Doyle&Doule,1987)提取叶用银杏种质基因组总DNA,在CTAB提取缓
冲液中加入β–巯基乙醇和PVP以除去酚和多糖物质,用紫外分光光度计测定提取的总DNA。
AFLP
分析参照Vos等(1995)的方法修改后进行,用
Pst
Ⅰ+
Mse
Ⅰ内切酶组合对基因组DNA进行限制
性酶切,并筛选出8对多态性高且稳定的引物组合进行扩增分析,扩增产物采用ABI3730XL自动
测序仪进行荧光检测,检测结果用GeneScan3.1软件进行分析,并将结果转化为0/1数据矩阵用于
统计分析。
2376园艺学报41卷
表2用于AFLP分析的接头与引物
Table2AdaptorsandprimersusedforAFLPanalysis
引物Primer序列Sequence
接头引物Adaptor
Pst
Ⅰ5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3′;3′-CATCTGACGCA-5′
Mse
Ⅰ5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′;3′-TACTCAGGACTCAT-5′
预扩引物Primerforthe
pre-PCRamplification
P05′-GACTGCGTACATGCAG-3′
M05′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′
选择性扩增引物
PrimerforAFLPamplification
P15′-GACTGCGTACATGCAGAA-3′
P25′-GACTGCGTACATGCAGAC-3′
P35′-GACTGCGTACATGCAGAG-3′
P45′-GACTGCGTACATGCAGAT-3′
P55′-GACTGCGTACATGCAGTA-3′
P65′-GACTGCGTACATGCAGTC-3′
P75′-GACTGCGTACATGCAGTG-3′
P85′-GACTGCGTACATGCAGTT-3′
M15′-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′
M25′-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3′
M35′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′
M45′-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3′
M55′-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3′
M65′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
M75′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′
M85′-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′
1.4数据统计与分析
利用Excel2007对叶片黄酮和萜内酯类含量进行整理分析及相关计算,并采用SAS9.0软件对
叶用银杏种质资源进行系统聚类分析。
利用Excel2007对AFLP扩增结果0/1数据矩阵进行分析,
依据每对引物扩增出来的总条带及多态性条带数,计算多态带百分率。
利用POPGENEversion1.31
软件计算遗传多样性指标:
等位基因数(
N
a)、有效等位基因数(
N
e)、Nei’s基因多样性(
H
)、Shannon’s
信息指数(
I
)。
采用NTSYSpcversion2.10e软件计算各种质间的遗传相似性矩阵,并进行UPGMA
聚类分析以了解叶用银杏种质资源间的遗传关系。
2结果与分析
2.1黄酮和萜内酯类含量分析
根据色谱图计算68份叶用银杏的黄酮和萜内酯类含量,图1为Y52种质的色谱图。
统计分析
68份叶用银杏种质资源叶片银杏的黄酮和萜内酯类含量,记录其最大值和最小值,并计算各种成分
的平均含量(表3),68份叶用银杏种质中Ga平均含量为0.0371%,其中Y16含量最多(0.1348%);
Gb平均含量为0.0185%,其中Y64含量最多(0.0472%);Gc平均含量为0.0280%,其中Y16含量
最多(0.0690%);Gj平均含量为0.0133%,其中Y64含量最多(0.0372%);Bb平均含量为0.0243%,
其中Y52含量最多(0.0582%);Te平均含量为0.1216%,其中Y64含量最多(0.2813%);GF平均
含量为1.7103%,其中Y64含量最多(2.4779%)。
雌雄银杏之间的黄酮和萜内酯类含量虽有所不同,
但其含量差别不大,差异并不显著。
图1Y52种质的黄酮和萜内酯类(A)和标准EGb(B)的HPLC色谱图
Fig.1HPLCchromatogramofflavonoidsandginkgolides(A)andEGb(B)intheY52germplasm
12期吴岐奎等:
叶用银杏种质资源黄酮和萜内酯类含量及AFLP遗传多样性分析2377
表3叶用银杏68份种质资源的黄酮和萜内酯类含量
Table3Theanalysisofflavonoidsandginkgolidescontentsfor68leaf-used
G
.
biloba
germplasms%
代号
Code
黄酮和萜内酯类
Flavonoidsandginkgolides
最大值
Maximum
最小值
Minimum
平均值
Average
雌株平均值
Averageoffemale
雄株平均值
Averageofmale
Ga银杏苦内酯AGinkgolideA0.1348(Y16)0.0083(Y3)0.0371±0.02330.0389±0.02800.0343±0.0127
Gb银杏苦内酯BGinkgolideB0.0472(Y64)0.0060(Y3)0.0185±0.00880.0181±0.00930.0190±0.0080
Gc银杏苦内酯CGinkgolideC0.0690(Y16)0.0119(Y3)0.0280±0.01180.0284±0.01160.0276±0.0123
Gj银杏苦内酯JGinkgolideJ0.0372(Y64)0.0028(Y46)0.0133±0.00780.0135±0.00780.0131±0.0078
Bb白果内酯BBilobalideB0.0582(Y52)0.0057(Y54)0.0243±0.01210.0248±0.01260.0236±0.0114
Te银杏萜内酯Ginkgolides0.2813(Y64)0.0028(Y6)0.1216±0.05020.1247±0.05690.1166±0.0373
GF黄酮Flavonoids2.4779(Y64)1.2697(Y4)1.7103±0.25131.7195±0.24671.6954±0.2629
注:
括号内为材料代号。
Note:
Plantcoedisinbracket.
根据叶片黄酮和萜内酯类含量对68份种质资源进行系统聚类分析(图2),在欧式距离为0.9
图2叶用银杏种质资源黄酮和萜内酯类含量系统聚类图
Fig.2Dendrogramofleaf-usedof
G.biloba
L.germplasmsbasedonflavonoidsandginkgolidescontents
2378园艺学报41卷
处,将其划分为6大类。
第Ⅰ类包含48份种质,第Ⅱ类包含12份种质,第Ⅲ类包含两份种质,第
Ⅳ类包含3份种质,第Ⅴ类包含2份种质,第Ⅵ类包含1份种质。
2.2遗传多样性分析
从64对引物中筛选出8对多态性高且表现稳定的引物组合对68份叶用银杏种质材料进行扩增
(部分结果见图3),,每对引物的鉴别效率为100%。
8对引物组合共扩增出1408条谱带,扩增片
段大小范围在70~500bp之间,其中多态性条带为1398条,平均每对引物组合扩增多态性条带174
条,每对引物组合多态性条带百分率(
PPB
)为99.28%。
8对引物组合共产生181条特异性条带(包
括3条缺失带),不同引物组合产生的特异性条带数量有所不同,
P
-GAC/
M
-CTC产生的
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
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- 银杏 种质 资源 黄酮 内酯 含量 AFLP 遗传 多样性 分析