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血清成分分析.docx
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血清成分分析
血清成分分析
作者:
冯晓帆
(温州大学生命与环境科学学院,浙江温州,325000)
摘要:
本次实验通过邻苯二甲醛法对血清中的胆固醇进行了定量测定;通过盐析、透析与浓缩首先把血清蛋白分成血清清蛋白与γ-球蛋白,再通过醋酸纤维薄膜电泳发对其进行了鉴定,发现血清中含有清蛋白、α1、α2、β、γ五种蛋白;我们还对血清成分之一的谷丙转氨酶分别对其活性和活力进行了鉴定与测定,让我们对血清的成分有比较深的了解。
关键词:
血清、谷丙转氨酶、胆固醇、蛋白
Thebloodserumingredientanalyzes
theauthor:
FengXiaofan
(WenzhouUniversitylifeandenvironmentalscienceinstitute,ZhejiangWenzhou,325000)
abstract:
Thisexperimenthascarriedonthequantitativedeterminationthroughtheneighbouringphenyldimethanallawtobloodserum'scholesterol;Throughthesaltingout,thedialysisandtheconcentrationfirstdivideintotheserumalbuminthebloodserumalbumenwithGamma-theglobulin,sentagainthroughtheacetatefilmelectrophoresistoithascarriedontheappraisal,discoveredthatinthebloodserumincludedthealbumen,α1,α2,Beta,Gammafivekindofproteins;WealsotoofGubloodserumingredientsBingthetransaminaseseparatelyhascarriedontheappraisalandthedeterminationtoitsactivenessandthevigor,letsushavethequitedeepunderstandingtobloodserum'singredient.
keyword:
Bloodserum,valleythirdtransaminase,cholesterol,protein
前言:
血液是凝固析出的淡黄色透明液体。
血液中许多化学成分的分析,都以血清为样品。
它能提供基本营养物质:
氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。
它也能提供激素和各种生长因子:
胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等,能提供结合蛋白:
结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁(结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用);它还能提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤与对培养中的细胞起到某些保护作用等等。
总而言之,血清在多方面都起着各种各样的作用,因此对血清成分的了解与分析就显得尤为重要,是实在必要的。
实验材料:
⑴、供试材料
1、兔子免疫的血清、兔子未免疫的血清、肝脏
②、邻苯二甲醛试剂:
称取邻苯二甲醛(A.R.)50mg,以无水乙醇(A.R.)溶解并稀释到50mL,冷藏,有效期1个半月。
③、标准胆固醇应用液(0.1mg/mL):
准确称取胆固醇(A.R.)100mg以醋酸定容至1000mL。
④、PBS、(NH4)2SO4溶液、双缩脲试剂、酪蛋白、蔗糖、BaCl2溶液
⑤、1%谷氨酸溶液(1%KOH溶液中和)1%丙酮酸钠溶液(用1%KOH溶液中和)
0.1%标准谷氨酸溶液0.1%标准丙氨酸溶液
⑥、酚的饱和水溶液将2份酚和2份水(按重量计算)混合后,放入分液漏斗中,振荡。
静止24h以后分层,将下部酚层放入瓶中备用。
新配制的酚展层剂可以反复使用1周。
⑦、0.1%KHCO3溶液0.025%一溴乙酸溶液(用1%KOH中和)2%乙酸溶液0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液1%KOH溶液9%NaCl溶液海砂0.4mol/LNaOH溶液
⑧、1/15mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液
取1/15mol/L磷酸氢二钠(称取Na2HPO49.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g,溶于蒸馏水中定容至1000mL)825mL;1/15mol/L磷酸二氢钾(称取KH2PO49.078g溶于蒸馏水中定容1000mL)175mL混合。
⑨、1、1mmol/L2,4-二硝基苯肼
称取2,4-二硝基苯肼20mg,溶解于10mL浓盐酸中,以蒸馏水定容至100mL。
2、2μmol/mL丙酮酸钠标准液
精确称取丙酮酸钠22mg,加磷酸缓冲液溶解后,定容至100mL。
临用前配制。
3、GPT基质液
称α-酮戊二酸,29.2mg(2mmol/L)及α-L-丙氨酸1.78g(200mmol/L)溶于50mL,pH=7.4的磷酸缓冲液中,加0.1mol/LNaOH溶液0.5mL,调pH为7.4,然后加磷酸缓冲液定溶至100mL,加少许氯仿防腐,置冰箱中可保存一周。
1实验仪器
1、离心机
2、透析袋
3、微量进样器
4、可见光分光光度计
5、凝胶柱
6、铁架台
7、水浴锅
8、电子分析天平
9、玻璃棒
10、试管、吸管、量筒、研钵、三角烧瓶、烧杯、锥形瓶、剪刀及滤纸
实验方法:
⑴邻苯二甲醛法
1、标准曲线的绘制
取清洁干燥试管5支,编号,按表2加入试剂。
表2邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制
编号
编号
编号
编号
0
1
2
3
4
标准胆固醇应用液/mL
0
0.1
0.2
0.3
0.4
醋酸/mL
0.4
0.3
0.2
0.1
0
邻苯二甲醛试剂/mL
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
蒸馏水/mL
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
混合酸/mL
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
100mL血清中总胆固醇含量/mg
0
100
200
300
400
A550nm
加毕,混匀,静置10min,以550nm波长比色测定,以吸光度值为纵坐标,胆固醇含量为横坐标,做标准曲线。
2、样品的测定
取2支清洁干燥试管,编号后,按表3加入试剂。
表3邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定
对照
样品
醋酸/mL
0.4
0.4
血清/mL
0.01
0.01
邻苯二甲醛试剂/mL
0
0.2
无水乙醇/mL
0.2
0
混合酸/mL*
4.0
4.0
加毕,混匀,静置10min,于550nm波长比色,以对照管校零点,对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量(mg)。
⑵、盐析法
血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤
取离心管一支,加入2mL血清
加入2mLPBS(稀释血清),摇匀
逐滴加入pH=7.2的(NH4)2SO4溶液2mL,边加边摇
静止30min,离心20min(v=3000rpm)
上清液(主要含有清蛋白)
沉 淀(主要含有γ-球蛋白)
加入3.132g(NH4)2SO4,使上清液饱和
加1mLPBS溶解
静止30min
逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液0.5mL
(相当于33%饱和(NH4)2SO4溶液)
离心、沉淀
加1mLPBS溶解沉淀
放置30min
放入透析袋
离心20min(v=3000rpm)*
*放弃离心后的上清液(主要是α、β球蛋白),沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白
⑶、透析与浓缩法
1.取玻璃纸(15cm×15cm)两张,折成袋状。
将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中,用线绳系紧上口。
2.用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中,使透析袋下半部浸入水中,将烧杯放在微量振荡器上振荡1h(中间换水1-2次)。
3.将透析袋取下,小心将线绳解开,用滴管吸收袋内的液体放入干净的试管中。
4.用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。
在用BaCl溶液检查烧液体的NH4+和SO42-。
记录实验现象,观察透析法除盐的结果。
5.将两透析袋取出,埋入蔗糖中浓缩。
⑷、凝胶层析法
凝胶层析的实验步骤
过程名称
实验步骤
凝胶预处理
4g葡萄糖胶G-25放入100mL烧杯中
50mL蒸馏水
小火煮沸1h
静止、冷却、倾弃蒸馏水
加入PBS10mL
轻轻搅拌至凝胶悬起
倾入10cm×1.0cm层析柱(用玻璃棉堵住下口,下口套一橡皮管)
装柱
将全部凝胶都倾入柱内,且液面接近凝胶面时,用螺旋夹将橡胶管夹紧,在将柱内凝胶面上平铺一张小圆滤纸片,然后小心放松螺旋夹,使液体缓慢流出,到液体刚好流入凝胶面时,将螺旋夹再夹紧,装柱工作完成。
加样
用胶头吸管将滤纸上方清液吸出,加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液,用胶塞封住上口,安装生理盐水加入装置。
洗脱
用生理盐水洗脱液进行洗脱。
打开螺旋夹,使液体的流速达到6-7dpm。
收集
混合液在凝胶柱中分离,蓝色的蓝葡聚糖在下方,黄色的重铬酸钾在上方。
用试管收集流出蓝、黄色液体,比色并画出洗脱曲线。
⑸、醋酸纤维素薄膜电泳法
醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤
浸泡
将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min,取出识别光面和麻面。
点样
用镊子将薄膜置于滤纸上,吸收多余的液体,用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线,利用载玻片一侧蘸取样品,于细线处点样。
电泳
将薄膜麻面朝下,平悬于电泳槽支架的滤纸桥上,点样一端靠近负极;通电后先使U=80V,待10min后,使U=120V电泳40min。
染色
将薄膜取出后,置于氨基黑10B染色剂重,染色10min。
漂洗
将薄膜取出后,移至漂洗液中,漂洗若干次,至无蛋白区无蓝黑色。
⑹、纸层析法
纸层析方法
取圆形层析滤纸1张,在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆
通过中心将滤纸绘成四等分扇形,用毛细管点样2-4次(直径不超过2mm)
在滤纸的圆心上剪一小孔,直径约1-2mm
取一小滤纸条,将下端剪成刷状,在卷成灯芯插入圆形小孔,不能使灯芯突出纸面
将圆形滤纸平放在盛有层析液(水饱和酚)培养皿上,使灯芯向下与溶剂接触
用大小相同的培养皿盖在滤纸上
溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层,直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止(展层时间为1h)
80-100℃烘箱干燥,喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液,80-100℃显色
实验结果:
1、血清中胆固醇的测定
胆固醇含量吸光度
对照
样品
不免疫血清
-0.001
-0.086
免疫血清
-0.001
-0.048
⑵、洗脱曲线
波峰低一点的蓝色曲线为蓝聚糖,波峰高一点的黄色曲线为重铬酸钾。
我们总共收集27小试管,1到5,12、27好试管都为无色,6到11试管为蓝色液体,13到26试管为黄色液体。
2、纤维素薄膜电泳的实验结果
0.44cm
0.58cm
0.60cm
0.65cm
全血清电泳图谱γ-球蛋白电泳图谱血清清蛋白电泳图谱
⑷、谷丙转氨酶活性的鉴定
对照2.20cm
丙2.85cm
谷2.75cm
丙2.80cm样
谷2.30cm样
⑸、谷丙转氨酶活力单位的测定
吸光度
活力单位
对照试管
0.000
不免疫血清
0.138
120GPT单位
免疫血清
0.215
190GPT单位
实验分析与讨论:
1、血清中胆固醇的吸光度为何为负值
分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。
样品的浓度不能过低,或者过高,超过光度计的测试范围。
某些操作因素也会影响吸光度的测定,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
在此实验中,我们得到的无论是不免疫的或是免疫的血清都不够纯净,都带有鲜红的颜色,因此对照组就带有鲜红的颜色。
样品在加了邻苯二甲醛之后,产生了紫红色物质。
在我们保证混合均匀试液,正确使用分光分度计等一系列规范操作的前提下,使吸光值出现负值的原因可能有:
一、样品的紫红色物质的吸光度比鲜红的对照组的吸光度还要低,实验提供的血清存在一定的问题:
二、混合酸中硫酸含量的高低对显色有影响(混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确)因而影响吸光度的测定。
2、全血清电泳图谱为什么只有两条区带
正常的实验结果应该是通过纤维素薄膜电泳可将血清蛋白质分为5条区带,从正极端依次分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白(如上图所示)而我们的实验结果却只有两条区带。
查资料得知,影响电泳迁移率的外界因素有电场强度,溶液的PH值,溶液的例子强度和电渗现象,影响电泳的内在因素有质点所带的静电荷的量、质点的大小和形状,所以内外因素共同导致了此次试验结果的不理想,分析如下:
一、点样的薄膜表面可能太干,样品不易进入膜内,造成点样起始点参差不起,影响分离效果;、点样没有做到恰到好处,可能太多,动作不够轻和稳,用力可能过大,以致损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果;三、缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中,不易分辨;四、操作过程没戴手套,未防止指纹污染对电泳结果的影响。
这次实验还应该注意的地方是放薄膜的时候毛面朝下,要注意放平,与滤网充分接触,但不要接触点样端,一定要将点样的一端放在接近负极的一方
3、为什么在谷丙转氨酶活性鉴定中,丙氨酸与谷氨酸爬得距离不同,又是为什么同是谷氨酸或者同是丙氨酸在纸面上爬的距离也不同
由于丙氨酸比谷氨酸在层析液的溶解度要大,所以丙氨酸在纸面跑得速度比谷氨酸快一些,远一些,也正因为如此我们才能观察到肝脏谷丙转氨酶的转氨作用。
而纸层析法的成功与否受很多因素的限制,比如说灯芯做的突出纸面,滤纸中心圆心上的小孔间的太大,戳得不够圆滑等等,都会影响样品在层析液中的扩散,就算同是谷氨酸或者都是丙氨酸在层析液当中的,爬行速度也有所不同。
其他原因可能就是点样出现了问题,没有均匀等量的点样,于是不同浓度的同一种物质在同一种层析液中扩散速度显然也会存在些许的差别。
4、一些实验的注意事项
凝胶层析法:
①加样要沿着壁小心翼翼的加,否这样品不容易进入溶胶当中;②实验的始终要让凝胶上残留生理盐水,不然凝胶会丧失作用了③控制好流速
谷丙转氨酶活性的鉴定:
①提取酶液时,一定要在低温研磨成浆,使酶不易失活②要使酶液在煮沸时不那么快蒸干,应放在试管而不是烧杯里,最好再加上脱脂棉塞③时时振荡水浴试管,使之充分反映
纸层析法:
层析液强腐蚀性要注意安全
实验结论:
经过此次实验,我们了解并掌握邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的原理和方法,熟悉了盐析、透析、浓缩、凝胶层析及其醋酸纤维薄膜电泳的原理与过程,也对纸层析法测酶活力有了进一步的了解,对血清有了比较全面的了解。
在实验中也发现了自己薄弱的实验操作技能与不太严谨的科学实验态度,希望自己能够再接再厉,让自己的实验水平能更上一层楼!
参考文献:
http:
//210.34.96.28/jpkc/sh/syzd.htm(福建医科大学生物化学精品课程)
(酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质)
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