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第十二章遗传毒性监测方法及其评价
P402
二章遗传毒性检测方法及其评价
第一节遗传毒理学测试的常规分类
过去的二十多年里,对各种环境因子遗传毒性效应的生物检测在毒理学研究中已占
有十分重要的地位,它们在环境污染监测及环境保护中发挥了积极的作用。
大量的遗传
学分析方法被用于识别生殖细胞诱变剂、体细胞诱变剂、潜在的致癌剂,以及与人类健康
相关的各种各样的遗传改变,所涉及的方法已经超过200种。
根据遗传毒性效应检测方
法所涉及的终端指标范围,可以把它们划分为三大类。
第一类检测基因突变;第二类检测
染色体畸变,包括染色体结构和/或数目的异常改变;第三类测定DNA损伤的标志、如
DNA损伤修复的激发、DNA加合物的形成、姐妹染色单体交换、体细胞重组及DNA链断
裂等。
表12-1列举了检测这三类遗传毒性效应的主要方法。
表12-1检测遗传毒性效应的主要方法
所检测的遗传终端指标
分析系统
I.基因突变分析
A.微生物
营养缺陷突变的回复
沙门氏杆菌一哺乳动物微粒体酶分析(Ames试验)
大肠杆菌WP2色氨酸回复突变分析
构巢曲霉或酵母的营养缺陷突变的回复
正向突变和小片段缺失分析
构巢曲霉或酵母腺嘌呤突变子分析
B.哺乳动物细胞分析
正向突变分析
小鼠淋巴瘤或人类细胞TK突变分析
中国仓鼠或人类细胞HGPRT突变分析
C.果蝇
生殖细胞基因突变和小片
性连锁隐性致死突变(SLRL)
段缺失分析
D.哺乳动物分析
生殖细胞基因突变和缺失分析
小鼠可见标记的特异基因座试验
小鼠生化特异基因座试验
引起小鼠骨骼或晶体缺陷的显性突变
体细胞基因突变
小鼠斑点测试(体细胞特异基因座试验)
啮齿类淋巴细胞HGPRT突变检测
转基因小鼠中细菌靶基因突变
小鼠、大鼠中lacl突变
小鼠lacZ突变
E.植物分析
花、花粉、种子突变
牙趾草雄蕊毛颜色、玉米waxy基因座和
不同植物的叶绿体基因突变分析
P403
续表12-1
所检测的遗传终端指标
分析系统
染色体畸变分析
哺乳动物细胞分析
染色体结构畸变
中国仓鼠或人类淋巴细胞中期相分析
人类淋巴细胞染色体断裂
细胞质裂阻断微核分析
异常细胞分裂’
着丝粒和染色体分别染色分析有丝分裂器异常
有丝分裂非整倍体
染色体计数检测超倍体
在具有完整细胞质的细胞中计数染色体得与失
着丝粒丢失
B果蝇分析
染色体结构畸变
遗传易位分析
性染色体非整倍体
性染色体丢失试验
C.哺乳动物分析
体细胞染色体损伤分析
啮齿类骨髓或淋巴细胞中期相分析
嗜多染红细胞微核分析
生殖细胞染色体损伤
卵母细胞、精原细胞、精母细胞细胞遗传学分析
生殖细胞染色体损伤间接证据
小鼠或大鼠显性致死分析
小鼠精细胞微核
生殖细胞可遗传的染色体畸变
小鼠遗传易位试验
有丝分裂非整倍体
骨髓细胞超倍体
利用动粒标记或FISH检测小鼠骨髓微核着丝粒
生殖细胞染色体不分离
染色体计数检测超倍体
D.真菌分析
有丝分裂非整倍体
酵母染色体得失的遗传学检测
减数分裂染色体不分离
酵母或构巢曲霉双体子囊孢子分析
E.植物分析
染色体畸变和微核分析
有丝分裂细胞和减数分裂细胞的细胞遗传学分析
非整倍体
单倍体小麦分析
Ⅲ.遗传损伤的其他标志检测
A.微生物分析
DNA损伤修复
枯草芽孢杆菌修复缺陷与野生型差别杀死分析
SOS诱发
大肠杆菌DNA损伤诱发的SOS效应
重组事件
酵母有丝分裂交换和基因转换分析
B.哺乳动物细胞分析
DNA损伤修复
大鼠肝细胞非程序性DNA合成(UDS)
DNA链断裂
碱洗脱、单细胞电泳(Comet试验)、脉冲场电泳
SCE诱发
人类或中国仓鼠细胞SCE
DNA加合物
人类或啮齿类细胞DNA加合物检测
C.果蝇分析
重组事件
眼或翅基因重组
生殖细胞DNA损伤
根据DNA加合物进行的分子剂量分析
P404
续表12-1
所检测的遗传终端指标
分析系统
D.哺乳动物分析
SCE诱发
啮齿类骨髓细胞SCE
DNA损伤修复
啮齿类肝细胞UDS
生殖细胞DNA损伤
根据DNA加合物进行的分子剂量分析
啮齿类生殖细胞UDS
啮齿类睾丸碱洗脱分析DNA链断裂
Ⅳ.检测DNA序列改变
的分子生物学技术
PCR-单链构象多态性分析
变性梯度凝胶电泳
双链构象多态分析法
变性一高压液相色谱分析
特异性等位基因扩增
化学裂解错配碱基法
酶错配切割法
切割酶片段长度多态性分析
限制性酶切位点突变分析
连接酶链式反应
微卫星DNA分析
单核苷酸多态性分析
DNA直接测序法
单细胞凝胶电泳
DNA芯片
本章将讨论上述四类测试方法的基本内容和主要的一些测试方法的利弊。
第二节基因突变测试概述
基因突变的检测主要有正向和反向二类。
正向突变改变野生型基因,使得有关基因
失活而表现出可检测的表型变异。
相反,回复突变是通过突变使原突变子中失活的基因
功能恢复,从而表现野生型表型。
一、微生物突变分析
由于微生物分析具有突变检测速度快、费用低、突变检出相对容易等方面的优势,相
关方法在遗传毒性物质的初步筛查中占有很重要的地位。
1.沙门氏菌一组氨酸回复突变分析(Salmonella-histidinereversionmutation)
用微生物检测突变的常用方法是在具有特定营养缺陷的菌株中选择回复个体。
沙门
氏杆菌组氨酸操纵子含有一系列结构基因如hisF、H、B、G、D、G、0。
Ames及其同事
所建立的沙门氏菌一组氨酸回复突变分析法,在一系列组氨酸依赖型菌株中检测发生了
回复突变而不再需要外源组氨酸的回复突变子。
实验利用若干不同基因型的菌株,每个
菌株具有其独特的回复突变“热点”序列,可以由不同类型的碱基置换和移码诱变剂诱发
P405
回复突变。
Ames菌株中除了组氨酸缺陷基因被引为检测诱发突变发生的靶标外,含有一
些其他帮助检测的基因及质粒。
常规使用的基本菌株已经历多次改进,它们的来源和特
性见表12-2。
表12-2Ames测试常规菌株及其特性
菌株
可检
基因型
突变
his-
rfa
uvrB
Apr(具
pKM101
质粒)
Ter(具
pAQ1
质粒)
TA1538
TA98
移码
hisD3052:
在D基因上含有可发生移码回复突变的4个
GC重复,TA98源于TA1583
raf
raf
△uvrB
AuvrB
APr
TA1535
TA100
碱基替换
碱基替换
和移码
hisG46:
G基因中正常GAG被GGG置换,TA100源于
TA1538
raf
raf
AuvrB
AuvrB
APr
TA1537
TA97
移码
TA1537含his3076,TA97含hisD6610。
前者D基因突
变处含有可发生移码突变的GGGGG,后者D基因突变
处含有6个串联C,在近旁出现交替的GC
raf
raf
△uvrB
AuvrB
APr
TA102
多方向
检测、致
癌剂、氧
化型物质
hisG428:
含无义突变(赭石)ATT,位于pAol质粒,并具
有30拷贝,提高了检测的敏感性
raf
+
APr
TCr
rfa:
细菌荚膜脂多糖屏障缺陷,表现为结晶紫敏感;ΔuurB:
紫外线损伤修复酶B缺失,表现为UV敏感;APr:
氨
苄青霉素抗性;TCr:
四环素抗性。
TA1538和TA98是通过对组氨酸操纵子中基因D的改造构建的,含有hisD3052等
位基因,该基因中含有可发生移码突变的4个GC重复。
TA98菌株中引入了pKM101质
粒,提高了对诱变剂的敏感性,同时提供了方便的选择标记,这类菌株主要检测移码诱变
剂。
TA1535及TA100菌株含有hisG46等位基因,其中含有GGG序列,可检测碱基替换
型回复突变,由于引入pKM101质粒的缘故,TA100不仅能检测碱基替换,亦能检测移码
突变。
TA1537和TA97在组氨酸D基因上具有不同的突变形式,这类菌株主要检测移
码突变诱变剂,TA97中引入了pKM101质粒并存在突变热点,比TA1537更敏感,并具
有更宽的移码诱变剂检测范围。
此外,由于TA97的突变位点与TA98接近,还可检出部
分TA98的诱变剂。
上述三类菌株的可回复突变关键位点上都含有GC碱基对。
在实际
工作中,TA98、TA100、TA97可分别代替TA1538、TA1535和TA1537。
TA102为另外一
种类型的测试菌株,含有hisG428基因,该基因可回复突变的关键位点含有AT碱基对和
无义突变序列ATT,在其质粒DNA上,也含有突变基因座的多个拷贝,从而增加了细胞
靶位点序列的数目,它可以检出TA100所不能检出的AT—GC转换。
利用TA100及
TA102可相互补充并可检测作用于GC和AT特异性的化学物质。
除了上述Ames测试的常规菌株,目前还不断的发展出新衍生菌株,它们具有更高的
敏感性和特异性的特点,如YG7104、YG7108,均从TA1535衍生而来,由于缺失编码06
一甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的基因ogtST而缺乏对烷化剂损伤的修复作用,专用
于对烷化剂引起的DNA损伤检测[1];YG1024、YG1029由于引入了乙酰转移酶基因,对
P406
硝基芳烃和芳香胺的敏感性比来源菌株高100倍以上[2,3]。
这些衍生菌株详见表12-3。
表12-3-些新的Ames测试菌株举例
菌株名称
来源
特性
YG7104.YG7108
TA1535
缺失编码06一甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的基因ogtST或adaST,使,
其缺乏对烷化剂损伤的修复作用,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检
测…
YG1006.YG1016
TA1538
引入了沙门氏杆菌乙酰转移酶或硝基还原酶基因,使其对硝基芳烃、芳香
YG1024.YG1029
TA98.TA100
胺的敏感性比来源菌株显著提高
YG1041.YG1042
TA98、TA100
引入了沙门氏杆菌乙酰转移酶及硝基还原酶基因[2~3]
YG3001.YG3002
TA1535.TA1975
来源菌株的8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶基因缺失,使其对氧化DNA损
伤的修复作用被破坏,对于氧化型诱变剂的检测敏感性提高‘t3
NM3009
TA1535
引入了含有0-乙酰转移酶及硝基还原酶基因的质粒(Psk1002),对硝基
芳烃的敏感性较高[5]
NM5004
TA1535
引入了含谷胱苷肽转移酶(GST)cDNA的质粒,用于检测需要GS,I、活化和
解毒的外源物质的检测[6]
NM2009
TA1535
为0-乙酰转移酶超表达菌株,在S9存在时,其对致癌芳香胺的检测活力
高于来源菌株数百倍[7-8]
TA7001-TA7006
为一组新的各自只带有一个组氨酸操纵子错义突变的测试菌株,具有检测
碱基专一性诱变剂的能力[9]
TA7041-TA7046
含有野生型的raf基因,功能类似TA100,TA102,但自发突变率极低,对
诱变剂敏感度更高[9]
DJ4501A2
含有沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P450基因
CyplA2[10]
许多化学物质在未经哺乳动物细胞代谢之前并无诱变性或致癌性,这些化学物质称
为前诱变剂或前致癌剂。
由于微生物和哺乳动物体外(invitro)测试系统缺乏整体动物
所具有的许多代谢能力,有必要为这些遗传学分析测试系统增添代谢功能,以检出前诱变
剂和前致癌剂。
为了模拟哺乳动物对外源物质的体内代谢活化过程,提高测试的准确性,
通常在Ames试验、其他原核生物测试和哺乳动物离体测试系统中添加哺乳动物肝微粒
体酶制剂(S9)作为外源物质代谢活化系统。
一般采用具有广谱诱导作用的Aroclor1254
(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶产生,尽管制备的S9与人类的情形有所差异,但是制备物中
含有活体情况下的大多数酶,适合于检测大多数遗传毒物。
对于一些经过哺乳动物体内
代谢活化具有诱变活性,或经代谢而解毒的环境外源物的检测,S9的应用具有重要意义。
在离体培养的肝细胞UDS分析和酵母测试中由于系统本身含有内源活化酶系而不必添
加外源活化系统。
随着研究的深入和技术的发展,许多外源物代谢基因已经引入测试菌
株,使测试菌株的相关代谢酶超表达,大大提高了它们对诱变剂的敏感性,在检测复杂混
P407
合物中的诱变剂时十分有价值。
为了克服S9制备上的困难和不稳定性,Josephy等利用
基因工程技术,将沙门氏菌的芳香胺N一乙酰转移酶基因和人类细胞色素P一450基因
CyplA2引入细胞,构建了在无外源S9时也可检出芳香胺诱变性的Ames测试菌株如
DJ4501A2[10]。
2.大肠杆菌WP2回复突变分析(E.coliWP2reversionmutation)
WP2是大肠杆菌的色氨酸缺陷型菌株,其对基因突变的分析原理类似于Ames测试,
WP2测试主要是检测受试物将WP2回复突变为野生型的能力。
常用的WP2系列菌株
具有不同的DNK损伤修复特性,如WP2的损伤修复特性正常,WP2uvr/A、WP67等为切
除修复缺陷。
由于该类测试菌的原始突变是碱基替换,所能够检测的诱变剂也是碱基替
换类型。
尽管Ames测试菌TAl00和TA98出现后,WP2在遗传毒性测试方面的使用已
经大为减少,但有研究指出WP2pKMl01所能检测的诱变剂能够覆盖大量的TAl02特
异诱变剂,WP2uvrA/pKMl01在诱变性检测上具有与TAl02的一致敏感性,同时对丙
烯酸酯(acrylicacidester)类衍生物、氯乙酸酯(chloroaceticacidester)类衍生物的遗传毒性检测具有特异性,所以在细菌的遗传毒性成套测试中,尤其在检测作用于AT碱基对的诱变剂时,一些科学家仍然倾向于采用Ames测试和WP2测试并进的思路[11,12]。
Blane0等
于1998年分别从WP2uvrA-pKMl01和WP2uvrA中构建了IC203和IC206菌株,前者由
于缺失OxyR即缺乏若干抗氧化酶基因的转录活化因子而用于检测氧化型诱变剂;后者
由于缺乏umuDC基因,从而不产生SOS反应,可检出那些不通过SOS反应的诱变
剂[133。
Toshihr0等通过向WP2uvrA中引入载有不同lacZ突变等位基因的质粒系统构
建了WP3101至WP3106菌株,它们可通过不同的lacZ回复突变检出不同种类的化学诱
变剂[14]。
3.酵母菌正向与回复突变分析(yeastforwardandreversionmutationanalysis)
作为简单的真核生物,酵母菌被广泛地用作遗传学的研究。
该类生物具有完整的真
.核生物细胞周期,通过培养条件的控制,酿酒酵母(S.cerevisiae)还可以存在稳定的单倍
体或二倍体状态。
利用酵母可以进行正向突变、回复突变、有丝分裂重组和非整倍体4种
类型的诱变检测。
酵母的ADEl、ADE2菌株在含少量腺嘌呤的培养基中生长为白色菌落,但当ADEl
或ADE2基因发生突变,产生的突变子adel或ade2出现嘌呤生物合成的阻滞,造成细胞
内红色色素积累,形成红色菌落。
利用这一原理,可进行环境化合物诱发正向突变的检
测。
发生突变的红色菌落亦可用于回复突变分析。
该系统的优点是在选择突变克隆时,
无须施加选择压力。
通过观察突变菌落色度的差异,可以判断是否具有突变固定的延迟,
即浅色度的菌落是由于包含部分野生型菌。
酵母的S7a也为正向突变分析菌株,能够检
出多环和杂环化合物的遗传毒性,其敏感性高于其他酵母菌测试株但低于细菌,适合于检
测具有较强杀菌作用的物质的遗传毒性[l5]。
利用酵母菌检测回复突变的原理,类似于沙门氏杆菌和大肠杆菌。
一般均始自特异
的营养缺陷型突变子,研究者通过观察野生型表型的出现,判断回复突变的发生。
常用菌
株如XVl85—14C,具有含褚石无义突变的ade2—1、ar94—17和lysJ一1基因;在arg4
P408
和lysl基因座发生回复突变后出现Ade-/Arg+或Ade-/Lys+红色菌落即出现ade2-I
的表型。
在无义密码子上的回复突变导致白色菌落产生(Ade+)。
Hampsey[16]曾报道了
一系列酵母细胞色素c基因内半胱氨酸(Cys-22)密码子发生单一碱基替换的突变菌
株,这些菌株发生回复突变后表现为可以利用未发酵碳源的野生型表型。
这一组菌株的
受试基因座构成了简单、可靠且无须作序列分析的特异突变靶点。
抗刀豆氨酸这一性状也是一种简便可靠的测试正向突变方法。
刀豆氨酸是有毒的精
氨酸类似物,把它放在正常单倍体酵母[刀豆氨酸敏感型(cans)]的培养基中时,细胞通
过刀豆氨酸的运转途径而吸收刀豆氨酸,最后使can8细胞死亡。
运转基因发生突变失活
后,细胞从头合成精氨酸,此时在培养基上生长的是刀豆氨酸抗性菌(canr)。
用这种方法
可检查碱基置换和移码突变剂。
很多具有遗传毒性的分子不能透过酵母菌的细胞膜,因而不能到达DNA靶分子,这
是酵母菌试验的局限性。
Staleva等在二倍体酿酒酵母测试株D7中引入了tsl突变基
因,构建了D7ts1菌株,该菌株对化学物质的通透性大为提高,使其对一些酵母特异性诱
变剂的敏感性提高4~6倍[17]。
目前有许多工作利用哺乳动物的某些基因在酵母具有类似功能的特性,构建了许多
在酵母中可以表达的不同物种DNA镶嵌分子,通过活体融合蛋白功能分析来检测哺乳
动物乃至人类的突变。
人类胱硫醚β-合成酶(CBS)基因突变可导致高胱氨酸血症和早
熟性动脉粥样硬化,人类CBS可代替酿酒酵母的CBS在酵母中发挥作用,Kruger等在酵
母构建了人类CBS分析系统,通过功能检测可以检出人类细胞中CBS基因突变,为人类
遗传疾病的诊断提供了新的思路和依据[18]。
人类Ⅱ型神经纤维瘤是由于肿瘤抑制基因
NF=2突变引起。
Kobayashi构建的酵母终止密码分析系统,可以通过人一酵母嵌合基因
的表达情况分析人类NF2基因的无义突变情况,为临床的NF2基因无义突变的检测提
供了有效的手段‘19]。
Andreutti-Zaugg等用类似的方法检测了人类结肠腺瘤性息肉(ade-
nomatouspolyposiscoli,APC)基因外显子1~14的突变,其中包括生殖细胞的突变,这些
突变用常规方法是很难检出的[20]。
二、哺乳动物细胞突变分析
由于基因组及其复杂性的差异,遗传毒理学测试常使用哺乳动物细胞的突变分析作
为微生物测试的补充。
所使用的细胞株靶位点突变机制应该明确。
表12-4研究基因突变常用的体外哺乳动物细胞株
细胞株
用作突变子选择的基因或性状
小鼠淋巴瘤细胞L5178Y
TK,HGPRT.OR
CHO
HGPRT.OR
V79
HGPRT、OR
人类细胞
HGPRT
表12-4列举了最常用的离体哺乳动物细胞基因突变(mammaliancellsgenemuta-
tion)测试系统。
这些测试一般利用中国仓鼠或人类淋巴细胞次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核
P409
糖转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因突变分析,HGPRT为x连锁的功能
性单倍体基因,所以在二倍体中若发生突变即可检出。
在CH0和V79细胞中HGPRT
基因座若出现大的缺失,可能导致其相邻的与细胞存活相关的基因缺失而出现致死效应,
所以该系统一般仅可检出点突变和一些微小缺失;此外该系统常因低pH、高渗透压等实
验因素而导致实验结果的偏差。
TK基因位于常染色体上,故用于检测的细胞株应该构
建为TK+/一杂合子。
小鼠淋巴瘤细胞株L5178Y就是这类杂合子。
在正常的TK+/
一杂合子中,包括TK基因在内的大的缺失并不一定导致细胞死亡,其同源染色体上等
位基因能提供相应的功能。
由于小鼠淋巴瘤细胞株L5178Y分析与Ames实验的互补性
差,假阳性结果偏高,所以已经很少使用。
图12—1给出了TK、HGPRT基因代谢有关的生化步骤。
利用这些基因发挥作用
的原理,将野生型细胞用受试物处理,随后由选择培养基培养,选择性杀死野生型细胞并
留下突变细胞,后者在随后的培养中形成克隆。
由此可计算突变率并进一步分析诱发突
变的特性。
上述测试手段能检出碱基置换和移码诱变剂。
图12—1TK、HGPRT基因代谢有关的生化步骤。
在含次黄嘌呤、氨甲蝶呤
核胸腺嘧啶核苷(HAT)的选择培养基上,正常生物合成途径被阻断,细胞若出
现HGPRT或TK基因突变,便不能存活。
还有一种细胞基因突变测试方法为乌本苷基因座(Ou)测试,其通过细胞是否出现乌
本苷抗性(OuR)突变来检出移码诱变剂。
由于乌本苷抗性的表达需要完整蛋白质存在,
而移码突变剂常导致转录过早中断,当基因产物全部或部分丧失时,移码突变效应为致死
效应。
该系统不适宜于常规诱变检测。
上述测试中发现的诱发突变子,均可以用分子生物学手段进一步分析受试物诱发突
变的类型和特性。
哺乳动物细胞基因突变检测技术,都可使用类似于hines沙门氏菌实验中所用的哺
乳动物S9制剂从而模拟哺乳动物活体的代谢情形。
三、昆虫突变分析
果蝇在遗传毒理学研究中具有双重功能,在短期测试中可用于识别诱变剂和致癌剂,同时
作为化学物质诱发突变的机制研究模型。
到20世纪80年代中期,果蝇在短期测试中的分析
主要局限于雄性生殖细胞遗传损伤分析。
黑腹果蝇(D.me/anogaster)的性连锁隐性致死
(SLRL.)试验是当时昆虫中惟一的常规基因突变测试手段,约700--750个化学物的突变诱发效
P410
应是通过这种方法检出的。
这一方法的优越性在于特异性(非致癌剂同时是非诱变剂的数目)
较高,几乎接近100%,但对于哺乳动物遗传毒性物质来讲,其敏感性较低(致癌剂为诱变剂的
数目)仅27%—79%。
因而,尽管在SLRL分析中哺乳动物遗传毒性检出率较低,但所检出的
阳性效应物质(SLRL≥5倍对照值)至少是跨种的诱变剂和哺乳动物致癌剂[21]。
表12-5果蝇体细胞DNA损伤测试方法[21]
测试系统
终端指标
靶组织
遗传标记及位置
测试原理
mwh/flr
由于突变或重组
翅毛
多重翅毛
mwh+/十flr3丧失杂合性,使隐性报道
嵌合系统
丧失杂合性
基因mwh、f2r3表达,雌雄均可
w/w+
体细胞突变插入
眼色素
白眼
w/w+丧失杂合性,表达隐性标记基因
嵌合系统
或丧失DNA突变
细胞
w,适宜于雌性
uhite-i'c
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- 第十二 遗传 毒性 监测 方法 及其 评价