突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究.docx
- 文档编号:640045
- 上传时间:2022-10-11
- 格式:DOCX
- 页数:4
- 大小:21.53KB
突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究.docx
《突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究.docx(4页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究
突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
作者:
杜勇,徐少勇,杨建业,张丽[摘要]目的:
研究外源性突变型p27(p27mt)基因对大肠癌的体内抑制作用。
方法:
应用细胞移植法把人大肠癌SW480细胞接种于BALB/c裸鼠皮下,构建大肠癌裸鼠模型,将腺病毒介导的突变型p27(Ad-p27mt)及LacZ注射到瘤体内,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,并进行细胞凋亡及MMP-9的相关检测。
结果:
Adp27mt基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制,MMP9的表达也明显较低,与LacZ、空白对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。
结论:
Adp27mt基因对大肠癌裸鼠的体内肿瘤有明显的抑制作用,并能抑制MMP9。
[关键词]腺病毒;p27mt;大肠癌;裸鼠;MMP9 Abstract:
ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectofadenovirusmediatedp27mtgenetramsferonxenograftofincolorectalcarcinomanudemice.MethodsThexenograftmodelofcolorectalcarcinomainnudemicewasestablishedbyinoculatingtheSW480cellsofhumancolorectalcarcinoma.Adp27mtandLacZwasinjectedintothetumorsrespectively.Thegrowthcurvesandthegrowthinhibitoryratesoftumorswereanalyzedandcomparedwithcontrolgroup.Apoptosisandmatrixmetalloproteinase9(MMP9)werealsodetected.ResultsAdp27mtmarkedlysuppressedthegrowthoftumorsandpromotedapoptosisofSW480cells,whichhadasignificantdifferencecomparedwithcontrolgroup(P0.01),andMMP9expressionwaslowerinAdp27mtgroupthanLaczgroupandcontrolgroup.ConclusionsAdp27mthasobviouslyinhibitoryeffectonthetumorgrowthofcolorectalcarcinomainnudemiceinvivo. Keywords:
Adenovirusp27mt;Colorectalcarcinoma;Nudemice;MMP9 正常情况下p27基因在G0/G1期表达增高,当细胞进入S期则表达下降。
p27基因高表达抑制细胞增殖是一个普遍现象。
将外源性p27基因导入细胞内造成p27蛋白高表达,可使细胞DNA合成强烈受抑制,细胞中止于G1期而停止增殖[1]。
把苏氨酸187换成蛋氨酸187,称为突变型p27mt,其比体内天然存在的p27有更强的抗肿瘤作用。
1材料和方法 1.1材料 SPF级BALB/c裸鼠购自湖北省实验动物中心,雌雄兼用,大肠癌SW480细胞购自第四军医大学细胞库,独立送回风动物饲养笼具(IVC笼具,苏杭动物实验器材公司),pORF9hp27mt质粒购自Invivogen公司,腺病毒骨架质粒pAdeasy1,质粒pShuttleCMV,pBluesciptⅡSK(+),Ad293细胞,大肠杆菌BJ5183和XL10-gold购自Stratagene公司,DH5α由郧阳医学院临床医学研究所保存;AgeⅠ,NheⅠ,KpnⅠ,NotⅠ,PacⅠ和PmeⅠ购自NewEnglandBiolabs公司,HindⅢ,EcoRⅠ,λDNAHindⅢmarker,200bpDNALadderdNTP,Taq酶和T4DNA连接酶购自华美生物公司,hp27mt引物由北京赛百盛生物公司设计合成;DMEM购自Gibco公司,CsCl购自Sigma公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
所用试剂AntiMMP9为鼠抗人单克隆浓缩型抗体,浓缩型免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒、胃蛋白酶和胰蛋白酶均购于福建迈新公司。
1.2方法 1.2.1人大肠癌裸鼠模型的构建:
重组腺病毒载体构建、鉴定、扩增见相关文献[2~3]。
取大肠癌SW480细胞加入DMEM培养液中置37℃,50ml/LCO2培养箱中培养、传代,反复传代至75cm2培养瓶共36瓶,取对数生长期的SW480细胞经2.5g/L胰蛋白酶消化后抽取100μl,释稀后应用台盼蓝染色确定细胞活力大于99%后,收集36瓶75cm2培养瓶中细胞并调整细胞浓度为1×108/L的细胞悬液,每只按0.2ml接种于4周龄BALB/c裸鼠右侧背部皮下,共36只,接种后饲养于我院临床医学研究所动物实验中心SPF实验室IVC笼具内,裸鼠所用饲料、水及用具均经灭菌处理后于超净工作台内更换,肿瘤潜伏期7~10d,至2周时肿瘤基本均长至0.4~10cm左右,去除个体肿瘤差异较大的裸鼠,选用肿瘤介于0.5cm左右裸鼠27只,随机分为3组,每组9只,分为空白对照组、LacZ组及p27mt组,采用肿瘤局部直接注射法,对照组中每只瘤体内注射PBS0.1ml,LacZ组为LacZ0.1ml(病毒含量1010pfu),实验组每只注射Adp27mt(病毒含量1010pfu)0.1ml,3d1次,共3次,每3日测量肿瘤最长径(A),最短径(B)一次,并根据公式V=л/6[(A+B)/2]3计算体积,4周后断颈椎处死动物,剥离肿瘤,称质量并绘制肿瘤生长曲线,按公式肿瘤生长抑制率(%)=(对照组肿瘤质量实验组肿瘤质量)/对照组肿瘤质量×100%,计算肿瘤生长抑制率。
1.2.2细胞凋亡检测:
无菌剥离肿瘤后用PBS漂洗3次,去除表面血污及脂肪、结缔组织后,切割成1mm3大小的碎块,装入试管中,加入30倍体积0.5g/L胶原酶,置37℃水浴中消化60min,间断振荡数次,终止消化后,用100目网眼的筛网过滤,去除未消化组织,收集细胞悬浮于离心管中,1200r/min离心5min,去上清液,用PBS漂洗、离心,800r/min,3min,共两次,以除去细胞碎片,用300目筛网过滤,去除粘连细胞,用PBS调整细胞密度至1×108/L,加入DNA结合性荧光染料PI染液(50mg/L)1ml,染色30min,流式细胞仪检测瘤细胞DNA含量及G1/GO期、G2/M期,S期百分数,检测时每个样品测5000个细胞,其荧光信号经流式细胞Multicycle细胞周期分析软件处理后以直方图和数据表方式显示。
1.2.3MMP9免疫组化检测:
采用SP法,按说明书步骤进行。
1.2.4结果判断:
低倍镜(×40)下找到癌巢周边基质区域,高倍镜(×200)下每张载玻片计数5个视野,计数每个视野中癌细胞总数及MMP9表达阳性的癌细胞数。
免疫组化MMP9表达强度根据阳性物质胞浆棕黄色着色深浅及阳性细胞数的百分比分为4级:
(-)阳性细胞数小于5%;(+)阳性细胞数在5%~25%之间;(++)阳性细胞数在26%~50%之间;(+++)阳性细胞数在50%以上。
1.3统计学处理应用SAS统计学软件,组内两两比较应用t检验,组间比较应用重复观测资料的χ2分析。
2结果 2.1对大肠癌裸鼠模型的抑制作用应用细胞接种法接种后,肿瘤生长潜伏期7~10d,14d肿瘤平均体积0.5cm3(0.48±0.23)左右,生长较为均一,动物生长状况良好,连续治疗观察4周,动物无死亡。
肿瘤生长曲线(图1):
组间比较p27mt组与对照组、LacZ组有显著性差异(P<0.01),空白对照组与LacZ组无统计学差异(P>0.05)。
2.2肿瘤生长抑制率28d后断颈椎处死动物,无菌剥离肿瘤,称瘤质量,抑瘤率38.2%(表1),p27mt组与对照组、LacZ组有显著性差异(P<0.01),空白对照组与LacZ组无统计学意义(P>0.05)。
表1肿瘤抑制率(略) 2.3细胞凋亡检测凋亡细胞p27mt组42.8%,变异系数CV6.3%,LacZ组6.38%,CV4.9%,空白对照组7.25%,CV5.2%。
p27mt组与对照组、LacZ组差异显著(P<0.01),空白对照组与LacZ组无统计学意义(P>0.05)。
2.4MMP9在结肠癌中的表达结肠癌组织中MMP9表达主要位于癌巢周边基质区域,MMP9在肿瘤组织内主要着色于癌细胞的胞浆,呈棕黄色(见图2)。
p27mt组MMP9表达明显低于LacZ组及空白对照组(P0.05,见表2)。
表2MMP-9组间阳性率比较(略) 3讨论 Wataru等[4]发现p27mRNA表达在40%的胃癌中有下降。
Shibata等[5]发现,在进展期食管鳞状上皮细胞癌中,p27表达越低,其肿瘤分化程度越差,浸润深度越大,认为p27表达是食管癌发生的早期事件。
Park等[6]发现p27高表达并最终导致肿瘤细胞在G1~S期阻滞,给裸鼠肺癌内直接注入病毒观察到肿瘤生长抑制,表明构建的p27腺病毒可作为目的基因用于肿瘤治疗。
但p27kipⅠ被称为“短寿蛋白质”,其原因在于细胞中泛素-蛋白酶体活性的增强,加速了p27kipⅠ蛋白的降解。
有人认为p27蛋白降解前必须首先发生磷酸化,cyclinECDK2可使p27蛋白187位苏氨酸磷酸化,从而影响其稳定性,磷酸化的p27再进行泛素化,蛋白分解酶可以识别泛素与p27之间的共价化合物,并将其降解,而泛素则可循环利用[7]。
Park等[6]发现Adp27mt有更强的生长抑制作用,能使更多的肿瘤细胞停滞于G1~S期,能产生更强的细胞凋亡作用,能产生更多的无活性DNA碎片从而导致细胞凋亡。
Jean等[8]进一步研究发现,突变型p27mt的半衰期超过12h,远长于野生型p27wt的2h。
表达p27mt的细胞能减少88%的荧光素酶的活性(P=0.001),而荧光素酶活性的降低能导致细胞翻译、复制能力的降低,从而导致细胞生存能力下降。
细胞培养显示,表达p27mt的细胞菌落明显少于p27wt(P=0.04)。
本实验亦提示Adp27mt对大肠癌动物模型体内肿瘤具有显著的抑制作用。
基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)与肿瘤的侵袭转移关系十分密切[9]它是一类锌依赖的细胞外蛋白水解酶家族,在人类,到目前为止共发现有19种[10],几乎能降解细胞外基质的所有成分,并被认为参与肿瘤的新生血管形成[11]。
降解细胞外基质、促进肿瘤新生血管形成是肿瘤侵袭转移的必要条件。
细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)和基底膜(basementmembrane,BM)可以限制肿瘤细胞的侵袭和转移。
癌细胞破坏ECM和BM这一功能由蛋白水解酶来完成,在众多的蛋白水解酶当中,MMPs家族因其能溶解所有的ECM和BM而倍受关注,MMP9是这一家族的重要成员之一,又称为明胶酶B,是降解BM成分Ⅳ型胶原的主要酶。
Bodey等[12~13]证实在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌等都有MMP9的过表
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 突变型 p27 基因治疗 裸鼠大 肠癌 移植 研究