保健食品有助于维持血糖健康水平功能检验方法.docx
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保健食品有助于维持血糖健康水平功能检验方法
有助于维持血糖健康水平功能检验方法
1动物实验
1.1实验动物
选用成年动物,选用小鼠(26
2g)或大鼠(180
20g),单一性别,大鼠每组8-12只、小鼠每组10-15只。
1.2材料
1.2.1试剂
四氧嘧啶(C4H2N2O4·H2O,分子量160.08)或链脲佐菌素、地塞米松磷酸钠注射液、葡萄糖或医用淀粉、血糖测定试纸或试剂盒,胰岛素、甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒
1.2.2高热能饲料
猪油10%、蔗糖15%、蛋黄粉15%、酪蛋白5%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持料52.6%
1.2.3仪器
血糖仪、全自动生化仪、可见光分光光度计、酶标仪、天平。
1.3剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个模型对照组,以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,高剂量一般不超过30倍,必要时设空白对照组。
同时设给予受试样品高剂量的正常动物组。
受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天。
1.4实验方法
1.4.1正常动物降糖实验
选健康成年动物按禁食3-5小时的血糖水平分组,随机选1个对照组和1个剂量组。
对照组给予溶剂,剂量组给予高剂量浓度受试样品,连续30天,测空腹血糖值(禁食同实验前),比较两组动物血糖值。
1.4.2高血糖模型降糖实验
方案一
1.4.2.1胰岛损伤高血糖模型
1.4.2.1.1原理
四氧嘧啶(或链脲佐菌素)是一种
细胞毒剂,可选择性地损伤多种动物的胰岛
细胞,造成胰岛素分泌低下,引起实验性糖尿病。
1.4.2.1.2造模方法
购入成年动物,适应3-5天后,随机取15只动物禁食3-5小时,测空腹血糖,作为该批次动物基础血糖值。
随后动物禁食24小时(自由饮水),注射四氧嘧啶(用前新鲜配制)造模,小鼠45-50mg/kgBW.iv或125-130mg/kgBW.ip,大鼠50-80mg/kgBW.iv或120-160mg/kgBW.ip。
5-7天后动物禁食3-5小时,测血糖,血糖值10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。
1.4.2.1.3高血糖模型动物降糖实验
选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平随机分组,设1个模型对照组和3个剂量组(组间差不大于1.1mmol/L)。
剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予溶剂,连续30天,测空腹血糖值(禁食同实验前),比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。
(实验前血糖值-实验后血糖值)
血糖下降率%=———————————————×100%
实验前血糖值
1.4.2.1.4高血糖模型动物糖耐量实验
剂量分组及受试样品给予时间同1.4.2.1.3。
各组动物禁食3-5小时,测定给葡萄糖或医用淀粉前(即0小时)血糖值,剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kgBW或医用淀粉3-5g/kgBW,测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值或给医用淀粉后1、2小时的血糖值,观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时间点(0、0.5、2小时)血糖值及血糖曲线下面积的变化。
(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5(2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5
血糖曲线下面积=———————————————+———————————————
22
方案二
1.4.2.2胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型(任选其一)
1.4.2.2.1地塞米松诱导胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型
1.4.2.2.1.1原理
糖皮质激素具有拮抗胰岛素生物效应的作用,可抑制靶组织对葡萄糖的摄取和利用,促进蛋白质和脂肪的分解及糖异生作用,导致糖、脂代谢紊乱,胰岛素抵抗,诱发实验性糖尿病。
1.4.2.2.1.2试验方法
购入健康雄性大鼠(150
20g),普通维持料适应饲养3-5天,禁食3-4小时,取尾血,测定空腹即给葡萄糖前(0小时)血糖值,给2.5g/kg·BW葡萄糖后测定0.5、2小时血糖值,作为该批次动物基础值。
以0、0.5小时血糖水平分5个组,即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组,每组15只。
空白对照组不做处理,3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,连续35天。
各组给予维持料饲养,1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料,喂饲2周后,模型对照组和3个剂量组在高热能饲料基础上分别给予地塞米松0.8mg/kgBW腹腔注射(0.008%地塞米松注射量1ml/100g体重),每日1次,连续10-12天。
试验结束,各组动物禁食3-4小时,检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。
1.4.2.2.1.3观察指标
1.4.2.2.1.3.1空腹血糖、糖耐量
各组动物禁食3-4小时,测定空腹血糖即给葡萄糖前(0小时)血糖值,剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,空白对照组不做处理,15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kgBW,测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值,若模型对照组0.5小时血糖值≥10mmol/L,或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型糖代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后(0.5、2小时)血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。
(实验前血糖值-实验后血糖值)
血糖下降率%=———————————————×100%
实验前血糖值
(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5(2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5
血糖曲线下面积=———————————————+————————————————
22
1.4.2.2.1.3.2胆固醇、甘油三脂
各组动物禁食3-4小时,检测血清胆固醇、甘油三脂,若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型脂代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组血脂变化。
1.4.2.2.1.3.3胰岛素
各组动物禁食3-4小时,检测血清胰岛素,模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降,且动物糖/脂代谢紊乱成立,判定胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型成功。
观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。
血糖×胰岛素
胰岛素抵抗指数=胰岛素/22.5e-㏑血糖≈——————————
22.5
1.4.2.2.2四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型
1.4.2.2.2.1原理
高热能饲料喂饲基础上,辅以小剂量四氧嘧啶(C4H2N2O4·H2O,分子量160.08),造成糖/脂代谢紊乱,胰岛素抵抗,诱发实验性糖尿病。
1.4.2.2.2.2造模方法
购入健康雄性大鼠(150
20g),普通维持料适应饲养3-5天,禁食3-4小时,取尾血,测定给葡萄糖前(即0小时)血糖值,给2.5g/kgBW葡萄糖后0.5、2小时血糖值,作为该批次动物基础值。
以0、0.5小时血糖水平分5个组,即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组,每组15只。
空白对照组不做处理,3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,连续33天。
各组给予维持料饲养1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料,喂饲3周后,模型对照组和3个剂量禁食24小时(不禁水),给予四氧嘧啶103-105mg/kgBW腹腔注射,注射量1ml/100g体重。
注射后继续给予高热能饲料喂饲3-5天。
试验结束,各组动物禁食3-4小时,检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。
1.4.2.2.2.3观察指标
1.4.2.2.2.3.1空腹血糖、糖耐量
各组动物禁食3-4小时,测定空腹血糖即给葡萄糖前(0小时)血糖值,剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,空白对照组不做处理,15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kgBW,测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值,若模型对照组0.5小时血糖值≥10mmol/L,或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型糖代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后(0.5、2小时)血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。
(实验前血糖值-实验后血糖值)
血糖下降率%=———————————————×100%
实验前血糖值
(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5(2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5
血糖曲线下面积=———————————————+———————————————
22
1.4.2.2.2.3.2胆固醇、甘油三脂
各组动物禁食3-4小时,检测血清胆固醇、甘油三脂,若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型脂代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组血脂变化。
1.4.2.2.2.3.3胰岛素
各组动物禁食3-4小时,检测血清胰岛素,模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降,且动物糖/脂代谢紊乱成立,判定胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型成功。
观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。
血糖×胰岛素
胰岛素抵抗指数=胰岛素/22.5e-㏑血糖≈——————————
22.5
1.5数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值 各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。 1.5.1指标判定 1.5.1.1正常动物降糖试验 血糖指标: 空腹血糖受试样品剂量组与对照组比较无统计学意义,判定对正常动物血糖无影响。 1.5.1.2高血糖模型降糖试验 空腹血糖指标: 模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有统计学意义,判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性。 糖耐量指标: 模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,在给葡萄糖或医用淀粉后0.5、2小时任一时间点血糖下降(或血糖下降百分率升高)有统计学意义,或0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低有统计学意义,判定该受试样品糖耐量指标结果阳性。 血脂指标: 模型成立的前提下,受试样品剂量组与模型对照组比较,血清胆固醇或甘油三酯下降有统计学意义,可判定该受试样品降血脂指标阳性。 1.5.2结果判定 方案一: 空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平功能动物实验结果阳性。 方案二: 空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,且血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高,对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平功能动物实验结果阳性。 1.6注意事项 1.6.1为了使实验动物糖代谢功能状态尽量保持一致,也为了准确地按体重计算受试样品的用量,实验前动物应严格禁食16h(不禁水),实验前后禁食条件应一致,鼠类在禁食的同时应更换衬垫物。 1.6.2如用血清样品进行测定,应于取血后30分钟内分离血清,分离后血清的含糖量在6小时内不变。 用血清制备的无蛋白血滤液可保存48小时以上。 1.6.3高浓度的还原性物质如VitC亦能与色素原竞争游离氧,干扰反应,使结果偏低。 1.6.4血红蛋
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- 保健食品 有助于 维持 血糖 健康 水平 功能 检验 方法