最新猪常见病PCR检测程序.docx
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最新猪常见病PCR检测程序
猪常见病PCR检测程序
猪
病
检
测
手
册
猪瘟RT-PCR检测程序
一、病毒RNA的提取
1、阳性对照RNA的提取
材料冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒(天跟公司产品)。
方法将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释,用1mlRNase-free管分装,每管500µl,-20℃保存。
取出冻存的猪瘟病毒,解冻后离心,取上清用于RNA的提取。
RNA提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
2、疑似病料RNA的提取
样品采集采集病死或扑杀的猪,取血清、扁桃体、淋巴结(包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结)、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织;待检活猪,用注射器取血5ml,4℃保存,送检(病料要新鲜,严禁反复冻融病料)。
附:
通常木乃伊胎不能作为检测样品。
对于新鲜流产的胎儿,可作为检测样品。
对于流产日龄较早的胎儿,可取整个胎儿保存;如果是晚期流产的胎儿,最好根据上述步骤,摘取相应组织,保存送检。
胎儿的保存方法同上。
组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mlPBS(PH7.2)继续研磨制成1:
3的组织匀浆液,转至1.5ml灭菌离心管中,8000r/min离心2min,取上清液用于RNA的提取;全血样品处理:
待血凝后取血清用于RNA的提取。
RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
二、RT-PCR反应
1、材料RT试剂盒(东洋纺产品)、PCR试剂盒(天跟公司产品)。
引物序列:
F:
5’-GACCTGGATGCGACTGACC-3’,19bp,TM为61.88。
R:
5’-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3’,20bp,TM为59.85。
扩增的目的片段为133bp。
2、RT体系及反应程序:
名称
弱毒疫苗阳性对照
检测病料
RNase-Free水
6µl
0
特异性下游引物
1µl
1µl
模板RNA
5µl
11µl
Total
12µl
12µl
置于PCR仪上65℃10min,立即冰浴5min。
然后加入以下试剂:
变性后的RNA溶液
12µl
5×RTbuffer
4µl
dNTPmixture
2µl
RNaseInhibitor
1µl
ReverTraACE
1µl
Total
20µl
按以下程序反转录:
1、42℃,45min
2、99℃,5min
将cDNA-20℃保存。
3、PCR反应体系及程序
ddH2O
7.5µl
cDNA
3µl
上游引物
1µl
下游引物
1µl
2×Mastermix
12.5µl
Total
25µl
反应程序:
1、94℃,3min
2、95℃,30sec
3、56℃,30sec×35cycles
4、72℃,1min
5、72℃,10min
三、电泳
用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶,100ml加入5µl染色液。
80V/70Ma电泳40min观察结果,在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下,检测样品如出现133bp的条带,判定为猪瘟病毒阳性。
猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序
一、病毒RNA的提取
1、阳性对照RNA的提取
材料冻干PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒(天跟公司产品)。
方法将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗用2ml生理盐水或PBS液稀释,用1mlRNAase-free管分装,每管200µl,-20℃保存。
取出冻存的病毒,解冻后用于RNA的提取。
RNA提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
2、疑似病料RNA的提取
样品采集病死或扑杀猪,取病死或扑杀猪,取血清、淋巴结(包括肺门和腹股沟淋巴结)、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织(检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本);待检活猪,用注射器取血5ml,4℃保存,送检(病料要新鲜,严禁反复冻融病料)。
附:
通常木乃伊胎不能作为检测样品。
对于新鲜流产的胎儿,可作为检测样品。
对于流产日龄较早的胎儿,可取整个胎儿保存;如果是晚期流产的胎儿,最好根据上述步骤,摘取相应组织,保存送检。
胎儿的保存方法同上。
组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mlPBS(pH7.2)继续研磨制成1:
3的组织匀浆液,转至1.5ml灭菌离心管中,8000r/min离心2min,取上清液用于RNA的提取;全血样品处理:
待血凝后取血清用于RNA的提取。
RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
二、RT-PCR反应
1、材料RT试剂盒(日本东洋纺产品)、PCR试剂盒(天跟公司产品)。
引物序列:
F:
5’-CAACGCCAGCAACGACAG-3’,18bp,TM为59.58。
R:
5’-ACGGAACCATCAAGCACAAC-3’,20bp,TM为57.8。
扩增的目的片段为468bp。
2、RT体系及反应程序:
名称
弱毒疫苗阳性对照
检测病料
RNase-Free水
6µl
0
特异性下游引物
1µl
1µl
模板RNA
5µl
11µl
Total
12µl
12µl
置于PCR仪上65℃10min,立即冰浴5min。
然后加入以下试剂:
变性后的RNA溶液
12µl
5×RTbuffer
4µl
dNTPmixture
2µl
RNaseInhibitor
1µl
ReverTraACE
1µl
Total
20µl
按以下程序反转录:
1、42℃,45min
2、99℃,5min
将cDNA-20℃保存。
3、PCR反应体系及程序
ddH2O
7.5µl
cDNA
3µl
上游引物
1µl
下游引物
1µl
2×Mastermix
12.5µl
Total
25µl
反应程序:
1、94℃,3min
2、95℃,30sec
3、56℃,30sec×35cycles
4、72℃,1min
5、72℃,10min
三、电泳
用TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶,100ml加入5µl染色液。
80V/70Ma电泳50min观察结果,在阳性对照出现468bp条带,阴性对照无条带出现的情况下,检测样品如出现468bp的条带,判定为PRRS病毒阳性。
高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序
一、病毒RNA的提取
1、阳性对照RNA的提取
材料阳性对照病料为该病的活疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒(天跟公司产品)。
方法RNA提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
2、疑似病料RNA的提取
样品采集病死或扑杀猪,取血清、淋巴结(包括肺门和腹股沟淋巴结)、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织(检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本);待检活猪,用注射器取血5ml,4℃保存,送检(病料要新鲜,严禁反复冻融病料)。
附:
通常木乃伊胎不能作为检测样品。
对于新鲜流产的胎儿,可作为检测样品。
对于流产日龄较早的胎儿,可取整个胎儿保存;如果是晚期流产的胎儿,最好根据上述步骤,摘取相应组织,保存送检。
胎儿的保存方法同上。
组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mlPBS继续研磨,匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中,8000r/min离心5min,取上清液用于RNA的提取;
全血样品处理:
待血凝后取血清用于RNA的提取。
RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
二、RT-PCR反应
1、材料RT试剂盒(日本东洋纺产品)、PCR试剂盒(天跟公司产品)。
引物序列:
F:
5’-TGATGGGCGACAATGTCC-3’,18bp,TM为55.56。
R:
5’-CGCAGGCAAATCCAGAGG-3’,18bp,TM为61.11。
扩增的目的片段为230bp。
2、RT体系及反应程序:
名称
弱毒疫苗阳性对照
检测病料
RNase-Free水
6µl
0
特异性下游引物
1µl
1µl
模板RNA
5µl
11µl
Total
12µl
12µl
置于PCR仪上65℃10min,立即冰浴5min。
然后加入以下试剂:
变性后的RNA溶液
12µl
5×RTbuffer
4µl
dNTPmixture
2µl
RNaseInhibitor
1µl
ReverTraACE
1µl
Total
20µl
按以下程序反转录:
1、42℃,45min
2、99℃,5min
将cDNA-20℃保存。
1、PCR反应体系及程序
ddH2O
7.5µl
cDNA
3µl
上游引物
1µl
下游引物
1µl
2×Mastermix
12.5µl
Total
25µl
反应程序:
1、94℃,3min
2、95℃,30sec
3、52℃,30sec×35cycles
4、72℃,1min
5、72℃,10min
三、电泳
用TAE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶,100ml加入5µl染色液。
80V/70Ma电泳40min观察结果,在阳性对照出现230bp条带,阴性对照无条带出现的情况下,检测样品如出现230bp的条带,判定为高致病性PRRS病毒阳性。
猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序
一、病毒RNA的提取
1、阳性对照RNA的提取
材料阳性对照病料为该病的弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒(天跟公司产品)。
方法RNA提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
2、疑似病料RNA的提取
样品采集采集病死或扑杀的猪,取血液、腹股沟淋巴结、脑脊髓液、死产胎儿的脑组织、分泌物、脾、肿胀的睾丸等组织病变与健康部交界处组织;待检活猪,用注射器取血5ml,4℃保存,送检(病料要新鲜,严禁反复冻融病料)。
附:
通常木乃伊胎不能作为检测样品。
对于新鲜流产的胎儿,可作为检测样品。
对于流产日龄较早的胎儿,可取整个胎儿保存;如果是晚期流产的胎儿,最好根据上述步骤,摘取相应组织,保存送检。
胎儿的保存方法同上。
组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨,加入1.5ml生理盐水继续研磨,匀浆后-20℃反复冻融3次,转至1.5ml灭菌离心管中,8000r/min离心2min,取上清液用于RNA的提取;全血样品处理:
待血凝后取血清用于RNA的提取。
RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行,最后用50µlRNase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。
三、RT-PCR反应
1、材料RT试剂盒(东洋纺产品)、PCR试剂盒(天跟公司产品)。
引物序列:
F:
5’-GCTTGTTGGACGGCAGAG-3’,18bp,TM为59.58。
R:
5’-AGCCACATGATTGAGCCTTC-3’,20bp,TM为57.8。
扩增的目的片段为238bp。
1、RT体系及反应程序:
名称
弱毒疫苗
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