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荧光定量PCR
一、样品RNA的抽提
1.匀浆
将-80℃冻结的RNA提取样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状,向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAisoPlus,并将组织样粉末覆盖。
2.抽提
室温放置5min,使核蛋白复合物完全溶解后转移至1.5mL无酶离心管中,室温静置5min,12000r/min,4℃离心15min;小心吸取上清液移入新离心管,加上清液的1/5体积量的氯仿,静置10min;12000r/min,4℃离心10min。
(此时分三层:
无色上清液、白色蛋白层、带颜色的下层有机相);
3.RNA沉淀
吸取上清液移至新离心管,切勿吸入中间蛋白层,向上清液中加入与上清液等量体积的异丙醇。
颠倒混匀后室温静置10min,12000r/min,4℃离心5min(此时底部会出现沉淀);
4.RNA洗涤
移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入1ml的75%乙醇(用DEPC水或无酶无菌水配制,超净台中配制),清洗RNA沉淀。
混匀后,4℃下12000r/min离心5分钟。
5.RNA溶解
吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
加入无RNA酶的水20-40μL用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、RNA浓度和质量的测定
1.1%-1.2%琼脂糖电泳检测RNA的完整性:
将从肌肉中提取的总RNA吸取5μL,加入1μL6XLoadingBuffer,混匀,点入1%琼脂糖凝胶点样孔中,120V电压电泳,经凝胶成像系统检测条带。
2.核酸蛋白分析仪检测OD;吸取2μL的RNA检测OD260/OD280检测含量与纯度,A260/A280在1.9-2.1之间,说明提取的总RNA质量很好,记录稀释后RNA的Conc值(浓度)。
三、实时定量引物
实时定量引物根据NCBI公布的基因序列,依据实时定量引物设计原则,使用软件Primer5.0设计,管家基因引物引用参考文献所列,引物由上海生工有限公司合成。
四、反转录
宝生物(大连)工程有限公司TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)进行反转录,体系及步骤如下;
1.反转录制备cDNA第一链
采用SYBRGreenqPCR法反转录,体系如表。
试剂
添加量(μL)
步骤1的反应液
10.0
PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ
1.0
RTPrimerMix*4
1.0
5XPrimeScriptBuffer(forRealTime)
4.0
RNaseFreedH2O
4.0
Total
20
按表成分在冰上配制反应液。
为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制MasterMix,然后再分装10μL到每个PCR反应管中。
轻柔混匀后立即进行反转录反应。
反转录条件;37℃15min;85℃5sec;4℃24h。
经过反转录反应得到的cDNA浓度为50ng/μL,将反转录产物于4℃冰箱中保存。
2.实时定量PCR扩增
本试验应用CFX96TMPCRDetectionSystem扩増仪的操作方法。
使用TaKaRaSYBR⑧PremixExTaqTMⅡ(TLiRNaseHPlus)进行实时定量PCR扩增。
(1)实时定量PCR反应体系
以上一步反转录获得的cDNA为模板,按表组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)。
以GAPDH基因作为参照基因,对样品中MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx基因在RNA水平进行相对定量分析。
目的基因与管家基因分别做3-4个平行样,每个岁龄的羊做10只平行,4次重复。
PCR反应体系如表:
(2)将配置好的反应体系装入12排八联管中,放入实时定量PCR仪中进行扩増。
设置PCR反应条件为:
(3)经PCR扩増反应后,将产物于4℃冰箱中保存。
3.PCR反应产物检验
吸取2μL的PCR反应产物,加入6XLoadingBuffer混匀,点入1.0%琼脂糖凝胶点样孔中,120V电压电泳,用凝胶成像系统检测PCR反应产物的质量。
五、数据统计分析
实时定量PCR数据分析方法:
本试验采用2-△△Ct法,计算公式:
(1)相对表达量(foldchange)=2-△△Ct;(2)△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)未处理组。
1. 紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:
100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。
(1)浓度测定
A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:
A260 ×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下:
RNA溶于40μlDEPC水中,取5μl,1:
100稀释至495μl的TE中,测得A260 =0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35μl,剩余RNA总量为:
35μl×0.84μg/μl=29.4μg
(2)纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
(1)制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25μl溶液。
胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
(2)准备RNA样品
取3μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
(3)电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。
5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
(4)紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成
1. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 总体积 10μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
2. 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
3. 取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
1. β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
2. 反应体系如下:
标准品反应体系
序号 反应物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10μl
2 阳性模板上游引物F 0.5μl
3 阳性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 阳性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
3. 管家基因反应体系:
序号 反应物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10μl
2 内参照上游引物F 0.5μl
3 内参照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待测样品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:
93℃ 2分钟,然后93℃1分钟,55℃2分钟,共40个循环。
五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
1. 针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
2. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 10×PCR缓冲液 2.5ul
2 MgCl2溶液 1.5ul
3 上游引物F 0.5ul
4 下游引物R 0.5ul
5 dNTP混合液 3ul
6 Taq聚合酶 1ul
7 cDNA 1ul
8 加水至总体积为 25ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟);72℃延伸5分钟。
(3)PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
(4)将PCR产物进行10倍梯度稀释:
将PCR产物进行10倍梯度稀释:
设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、待测样品的待测基因实时定量PCR
1. 所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
2. 体系配置如下:
序号 反应物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
(3)将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。
反应条件为:
93℃2分钟预变性,然后按93℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。
七、实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:
PrimerPremier5.0,并遵循以下原则:
引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
八、电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。
PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
PCR-SSCP分析的基本程序为:
首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。
这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。
相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。
PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开。
由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果,现已发展多种PCR-SSCP技术,各有其优势及适用领域。
例如,可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷,也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。
这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。
在进行PCR扩增特定靶基因序列时,利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增,使扩增产物带有同位素标记物,然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影显示结果。
利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物,均可使产物信号增强几个数量级。
二者相比较,前者经济、扩增特异性强,多用于大样本的检测和筛选;后者操作简便,适于一般实验室开展,可用于小样本或大样本的检测和筛查。
本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。
一、试剂准备
⒈ PCR相关试剂
⒉ α-32P-dCTP
⒊ 30%聚丙烯酰胺(29:
1):
丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g,溶于100mlddH2O中,4℃保存。
⒋ 10%过硫酸铵配制方法:
1g过硫酸铵,溶于10mlddH2O中,4OC保存(可用数周)。
⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
⒍5×TBE缓冲液:
Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA(pH8.0)20ml,加ddH2O至1000ml。
7.变性上样液:
95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mMEDTA(pH8.0)
二、操作步骤
⒈PCR扩增
反应总体积为10μl,在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分:
10×buffer 1μl
dNTPmix 70μM
DNA模板100ng
引物及TaqDNA酶依实验设计要求按比例加入
α-32P-dCTP 0.1μl
加ddH2O至10μl
按实验设计循环参数进行扩增,获取扩增产物。
⒉聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴电泳槽玻璃板的处理:
用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗3次,晾干,95%乙醇擦拭,自然干燥。
用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上,5~10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。
在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐,用固定夹夹紧两块玻璃,并用玻璃胶带封边。
⑵制胶:
按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,一般来讲使用5%~8%的凝胶较为合适。
轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气(开始时要缓慢)除气泡,加35μlTEMED至聚丙烯酰胺混合液中,混匀。
用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液,将玻璃模具倾斜成60O角,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具顶部。
立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳子时把胶孔拔断)。
由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1hr。
将封口玻璃胶带掀去,放入电泳槽,凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽,用大号固定夹固定住两侧。
在上下电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。
小心取出点样梳,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
⑶扩增产物的处理:
将PCR扩增产物与变性上样液按1:
5的比例加入0.5ml微量离心管中,混匀。
样品上胶前应98℃变性10min,立即冰浴骤冷。
取约3~5μl变性样品(根据点样孔的大小决定上样量),以微量加样器上样,(上样时要注意不要有气泡冲散样品,而且速度要快,时间长了样品易于扩散)。
⑷电泳:
电泳槽接上电极(上槽接负极,下槽接正极)开启电源,根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。
通常室温下以l~5V/cm电泳。
⑸剥胶:
电泳结束后,倒弃电泳缓冲液,取下电泳胶玻璃,用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃,凝胶应附着在一块玻璃上,切去凝胶左上角,作为点样顺序标记。
剪一张与玻璃同样大小的滤纸,严密覆盖于凝胶上,顺一个方向将凝胶缓慢取下,用保鲜膜盖于胶面并包好,避免膜和胶之间产生气泡或皱折,将凝胶固定在X线片夹中。
⑹放射自显影:
在暗室中将X线片贴于胶面,盖严片夹,用黑布将X线片夹包裹,置-70OC放射自显影。
曝光时间根据同位素的强度而定,约24h~10d。
⑺冲洗胶片从-70oC取出X线片夹,在暗室内迅速取出X线片,立即显影,以免使X线片上出现过多的冷凝水。
(如果想再得到一张放射自显影影像,可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。
如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温,并擦去冷凝水后再装入新的X线片)。
依次按以下程序操作进行显影:
X线片显影液显影1-5min
水洗lmin
定影液定影5min
流动水冲洗15min
所有使用液的温度应为18~20OC为宜。
三、注意事项
⒈核酸片段的大小:
用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高。
对于<200bp的片段,SSCP可发现其中70%的变异;对于300bP左右的片段则只能发现其中50%的变异;而>500bp的片段,则仅能检出10%~3O%的变异,因此,<300bP,尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。
对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理,可以用限制性酶消化PCR产物,产生小于400bP的DNA片段,再进行SSCP分析。
⒉游离引物:
游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6nM都有明显影响。
因此,应尽可能除去游离引物。
可以采用不对称引物扩增方法,尽可能消耗多余的引物。
也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。
或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰。
⒊低浓度变性剂:
凝胶中加入低浓度的变性剂,如5%-10%甘油、5%尿素或甲酸胺、10%二甲亚砜(DMSO)或蔗糖等有助于提高敏感性,可能是因为轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率。
但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。
因此,对同一序列使用2~3种条件做SSCP,可能提高敏感性。
⒋电泳温度:
一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素,温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响突变的检出。
室温下电泳适于大多数情况,但由于在电泳时温度会升高,为确保电泳温度相对恒定,应采取以下措施:
减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气冷却或循环水冷却等。
⒌凝胶的长度:
可用测序板进行SSCP分析,凝胶板长度在40cm以上。
⒍凝胶浓度及厚度:
凝胶浓度很重要,一般使用5%~8%的凝胶,凝胶浓度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时,最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率。
凝胶的厚度对SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝胶越薄越好。
⒎假阴性:
一般认为,如没有污染,PCR-SSCP分析不存在假阳性结果,但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。
如果有阳性和阴性对照,结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是否为突变带。
由于PCR-SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。
应通过设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。
但对未知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除。
8.结果分析:
单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链带。
PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链。
如变性不彻底,残留双链亦可形成一条带.因此,PCR-SSCP分析结果至少显示三条带。
但是,由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象,检出三条或四条单链带就不足为奇。
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