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微生物检测EP
2.6.12无菌产品的微生物检测:
微生物计数检测
1.简介
下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。
该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当以此为目的时,按照下面给出的规定进行,包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。
此方法不适用于微生物作为有效成分的产品。
若使用了其他的微生物程序,包括自动方法,则应提供其等同于药典方法的证明。
2.一般步骤
检测必须在设定的条件下进行,以避免外来的微生物污染。
为避免此污染所采取的预防措施必须不影响微生物在检测中将要表现出的特性。
若产品具有抗菌活性,则必须除去或中和。
如果因此而是用了钝化剂,则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
如果在处理样品时使用了表面活性剂,必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。
3.计数方法
用薄膜过滤法和平皿计数法。
最大机率法(MPN)一般来说最不准确的微生物计数方法。
但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。
所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。
必须证明所选择的方法的适用性。
4.促进生长试验、计数方法的适用性和阴性对照
4.1总体要求
必须证明检测方法检测产品中微生物的能力。
如果检测操作或产品有变更,且该变更能够影响检测结果,则必须证明其适用性。
4.2菌株的准备
使用菌株的标准稳定悬浮液或参照以下方法制备。
使用种子库维护系统(种子库系统),以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。
按照表2.6.12-1的描述分开培养每一细菌和真菌的菌株。
使用PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或PH7.2硫酸盐缓冲液制备悬浮液。
如果要制备A.brasiliensis孢子悬浮液,可在缓冲液中加入0.05%聚山梨酯80。
配好的悬浮液需在2小时内使用,如果在2-8℃贮存,则在24小时内使用即可。
作为一种替代的方法,可以配制并稀释植物细胞A.brasiliensis或B.subtilisde新鲜混悬液,配制一份孢子的稳定混悬液,然后用适量的此孢子混悬液进行接种。
这种稳定的孢子混悬液应在2-8℃贮存一段验证时间。
4.3阴性对照
为确认试验条件,使用特定稀释剂代替试验制剂进行阴性对照。
该对照中必须无微生物生长。
当检测第五部分列出的样品时,也需要进行阴性对照。
阴性对照失败必须进行调查。
4.4培养基促生长
对每一批现成的培养基和由脱水培养基制备的培养基或由原料制备的培养基进行检测。
接种少量表2.6.12-1中列出的微生物(不超过100CFU)于大豆酪蛋白消化物肉汤和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中。
在氏-葡萄糖琼脂中接种少量的表2.6.12-1中列出的微生物(不超过100CFU)。
按照表2.6.12-1中列出条件培养。
表2.6.12-1检测微生物的制备和使用
微生物
检测菌株的准备
生长促进
计数方法的适用性
需氧菌总数
酵母菌和霉
菌总量
需氧菌总数
酵母菌和霉
菌总量
金黄色葡萄球菌
如:
ATCC6538
NCIMB9518
CIP4.83
NBRC13276
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
30-35℃
18-24h
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
大豆酪蛋白消化琼脂/MPN大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
绿脓杆菌,如:
ATCC9027
NCIMB8626
CIP82.118
NBRC13275
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
30-35℃
18-24h
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
大豆酪蛋白消化琼脂/MPN大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
枯草芽孢杆菌,
如:
ATCC6633
NCIMB8054
CIP52.62
NBRC3134
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
30-35℃
18-24h
大豆酪蛋白消化琼脂和大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
大豆酪蛋白消化琼脂/MPN大豆酪蛋白消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
白色念珠菌,如:
ATCC10231
NCPF3179
IP48.72
NBRC1594
沙氏-葡萄糖琼脂或沙氏-葡萄糖肉汤
20-25℃
2-3天
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
MPN:
不适用
沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
曲霉巴西,如:
ATCC16404
IMI149007
IP1431.83
NBRC9455
沙氏-葡萄糖琼脂或沙氏-葡萄糖肉汤
20-25℃
5-7天,或直到产生产孢
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
大豆酪蛋白消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
MPN:
不适用
沙氏-葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
对于固体培养基,由一个大于2的因子和由标准化接种物计算值得到的增长必须相同。
对于新制备的接种物,微生物的生长情况应该和之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较。
如果与之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较,微生物的生长情况是明显可见的,那么液体培养基亦适用。
4.5计数方法的适用性
4-5-1制备样品。
制备样品的方法取决于待测品的物理性质。
如果以下程序均不能达到令人满意的效果,则应开发其他替代的程序。
水溶性待测品。
将待测品溶解或稀释(通常按1:
10稀释)在PH7.2磷酸盐缓冲液、PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或大豆酪蛋白消化肉汤中检查,如果需要调节PH到6-8。
如果需要,可用同样的稀释剂进一步稀释。
不溶于水的非脂肪类待测品。
在PH7.2磷酸盐缓冲液、PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或大豆酪蛋白消化肉汤中制备待测品混悬液(通常按1:
10稀释),可加入例如1g/L的聚山梨酯这一类表面活性剂来帮助亲水性差的物质形成混悬液。
如果需要调节PH到6-8。
如果需要,可用同样的稀释剂进一步稀释。
脂肪类待测品。
在肉豆蔻酸异丙酯中溶解样品,过滤除菌或与最小剂量的无菌聚山梨酯80或其他非抑制类的表面活性剂混合检查,如果需要的话在40℃以下加热,特殊情况在45℃以下加热,充分混合,必要的话用水浴维持温度。
加入足够的预热过的稀释剂将原始的待测品按1:
10稀释。
充分混合且在乳胶形成的最短时间内保持温度。
用含有适量的无菌聚山梨酯80或其他非抑制类的表面活性剂的稀释剂进行连续的十倍稀释。
气溶胶形成的流体或固体。
将待测品无菌转移入一个薄膜过滤器或无菌容器进行进一步的取样,使用被检测容器中的全部或一部分剂量。
透皮贴剂。
移除透皮贴剂的保护层,将其放置在无菌的玻璃或塑料盘中,有粘性的一面向上,用一层能透气的盖住透皮贴剂的粘性表面以防其粘在一起,然后将贴剂转移到适量的含有像聚山梨酯80和/或卵磷脂等钝化剂的稀释剂中,大力振摇至少30分钟。
4-5-2.接种和稀释
在上述样品中(4-5-1)和对照中计入适量的微生物以得到不大于100CFU的接种物。
接种混悬液的体积不应超过稀释样品的1%。
为证明产品可接受的微生物恢回收率,检测时必须使用制备样品的最低可能稀释系数。
如有由于抗菌活性或可溶性差而无法实现,必须进一步寻求合适的方案。
若不能避免对样品生长的抑制,在中和、稀释或过滤后应加入等分的微生物混悬液。
4-5-3抗菌活性的中和/去除
按照4-5-2所描述方法稀释和4-5-4描述的程序进行培养的样品中微生物的回收率,与对照中微生物的回收率相比比较应是一致的。
如果生长被禁止(被一个大于2的因素减少),改变特殊计数检测的程序以确保结果的有效性。
程序的变更应包括,例如,
(1)稀释剂或培养基体积的增加;
(2)在稀释剂中加入特殊的或一般的中和剂;(3)薄膜过滤;(4)上述所有措施的结合。
中和剂。
中和剂可以用于中和抗菌活性(表2.6.12-2),最好在灭菌前加入到所选的稀释剂和培养基中。
如果使用,必须通过进行有中和剂和无产品的空白试验证明其有效性及其对微生物无毒性
表2.6.12-2.-干扰物质的常见中和剂
干扰物质
潜在中和方法
戊二醛、汞
亚硫酸氢钠()
酚醛树脂、酒精、醛、山梨酸酯
稀释
醛
甘氨酸
季铵盐化合物(QACs)、苯甲酸酯、二双胍类
卵磷脂
季铵盐化合物(QACs)、碘、苯甲酸酯
聚山梨酯
汞制剂
硫乙醇酸盐
汞制剂、卤素、醛
硫乙醇酸盐
EDTA
Mg2+或Ca2+
如果没有合适的中和方法,可以假设已接种微生物的分离失败是由于产品的微生物活性。
这些信息表明样品不容易被给出的微生物污染。
但是,有可能这种产品只抑制了一些在此指定的微生物,但不抑制一些不包含在测试菌株内或不具有代表性的微生物。
因此,使用与微生物生长和规定的可接受标准相兼容的最大稀释因子进行检测。
4-5-4.产品中微生物的回收率
对每种列出的微生物,分别进行试验。
只对加入试验菌株的进行计数。
4-5-4-1.薄膜过滤
使用的薄膜过滤器的标称孔径应不大于0.45um。
这种过滤器的材质是特殊的,故细菌的保留效率不会被所调查的样品组成影响。
对每种列出的微生物,使用一个过滤器。
将适量的按照4-5-1到4-5-3描述的方法制备的样品移至(最好为1克产品;如果要更少的CFU,则要更少量)薄膜过滤器中,立即过滤,用适量的稀释剂冲洗薄膜过滤器。
若检测需氧菌总数,则将薄膜过滤器移至大豆酪蛋白消化琼脂中。
若检测酵母菌/霉菌总数,则将薄膜过滤器移至沙氏-葡萄糖琼脂表面。
按照表2.6.12-1所描述的方法进行计数。
4-5-4-2.平皿计数法
进行平皿计数法培养基必须一式两份,结果用二者的平均数。
4-5-4-2-1.注皿法
用直径为9cm的培养皿,每个培养皿加1ml按照4-5-1到4-5-3描述的方法制备的样品和15-20m大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏-葡萄糖琼脂,两种培养基的温度均应小于45℃。
如使用了更大的培养皿,琼脂培养基的数量也要相应的增加。
对表2.6.12-1列出的每种微生物,至少要使用两个培养皿。
培养皿按照表2.6.12-1中所示的方法培养。
用数学方法统计培养基和计算原始接种的CFU数。
4-5-4-2-2.表面分布法
用直径为9cm的培养皿,每个培养皿加15-20ml45℃左右的大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏-葡萄糖琼脂,使其凝固。
如使用了更大的培养皿,琼脂培养基的数量也要相应的增加。
干燥培养皿,例如在空气层流罩柜或恒温箱内。
对表2.6.12-1列出的每种微生物,至少要使用两个培养皿。
在培养基表面展开不少于0.1ml的按照4-5-1至4-5-3的描述制备的样品。
按照4-5-4-2-1所描述的培养和计数。
4-5-4-3.最大机率法
最大机率法的精确性和准确性均小于薄膜过滤法和平皿计数法。
霉菌的计数结果尤为不可靠。
如果没有其他可靠的方法情况下,则在TAMC计数中可使用最大机率法。
如果对使用这种方法给出了合理说明,则按照以下规定进行。
按照4-5-1至4-5-3的描述至少对待测品进行连续3次十倍稀释。
对每个等级的稀释,1g或1ml等分3份分别接种到3个盛有9-10ml大豆酪蛋白消化肉汤的试管中。
如果必要,可在培养基中加入像聚山梨酯80等表面活性剂或灭活剂等抗菌剂。
因此,如果进行了三个等级的稀释,就接种了9支试管。
在30-35℃的条件下培养所有试管,不超过3天。
若由于产品的性质导致测试结果的不准确或不确定,则在相同的肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂进行传代培养,在相同温度及相同的条件下培养1-2天,并以传代培养的结果作为检测结果。
根据表2.6.12-3,确定待测样品每克或每毫升中微生物最大几率值。
。
4-6.结果和说明
在确定薄膜过滤法和平皿计数法的适用性时,样品中测试微生物的平均值通过一个大于2的因子后,应与在表4-5-2规定的未加待测品的对照中的值一致。
当确认最大机率法的适用性时,接种的计算值必须在对照结果限度置信区间的95%内。
如果用上述的任一方法对微生物进行检测,检测结果无法达到规定的标准,可以使用与标准最接近的方法和实验条件来检测样品。
5.样品的测试
5.1检验用的样品数
除另有规定外,取10g或10ml待测样品。
对于气溶胶中的固体或液体,取10个单位容量。
对于透皮贴剂,取10剂。
表2.6.12.3-微生物最大几率值
每组试管中所观察到的生长情况
每克或每毫升样
品内的MPN
95%置信限
每支试管中样品的克或毫升数
0.1
0.01
0.001
0
0
0
<3
0-9.4
0
0
1
3
0.1-9.5
0
1
0
3
0.1-10
0
1
1
6.1
1.2-17
0
2
0
6.2
1.2-17
0
3
0
9.4
3.5-35
1
0
0
3.6
0.2-17
1
0
1
7.2
1.2-17
1
0
2
11
4-35
1
1
0
7.4
1.3-20
1
1
1
11
4-35
1
2
0
11
4-35
1
2
1
15
5-38
1
3
0
16
5-38
2
0
0
9.2
1.5-35
2
0
1
14
4-35
2
0
2
20
5-38
2
1
0
15
4-38
2
1
1
20
5-38
2
1
2
27
9-94
2
2
0
21
5-40
2
2
1
28
9-94
2
2
2
35
9-94
2
3
0
29
9-94
2
3
1
36
9-94
3
0
0
23
5-94
3
0
1
38
9-104
3
0
2
64
16-181
3
1
0
43
9-181
3
1
1
75
17-199
3
1
2
120
30-360
3
1
3
160
30-380
3
2
0
93
18-360
3
2
1
150
30-380
3
2
2
210
30-400
3
2
3
290
90-990
3
3
0
240
40-990
3
3
1
460
90-1980
3
3
2
1100
200-4000
3
3
3
>1100
对于下述活性物质使用的样品量会减少:
每个单位剂量(如片、粒、支)小于或等于1mg,或每克或每ml(对于某些无法用单位剂量来衡量的制剂)中药物活性物质的含量小于1mg。
在上述情况中,所使用的待测样品量应不少于10个单位剂量或取用10g或10ml样品。
对于用作活性成分的物质,如果样品量已被限制或批量很小(例如小于1000ml或1000g),测试取样量应为批量的1%,除非另有规定或给出合理的理由或是被批准可以使用更少用量的样品。
对于批量少于200个实体的样品(例如,用于临床试验的),则取样量可减少至2单位,若批量小于实际数目100,则取样量可减少至1单位。
对散装物料和容器内的制剂进行随机取样。
为得到可靠的取样量,可将多个容器内的取样混合供样。
5.2样品的检测
5-2-1薄膜过滤
使用可以移动到培养基内的过滤器。
用第四部分描述的合适的方法来准备样品,请将适量的样品分别移入两个薄膜过滤器中,并立即过滤。
按照适当的程序清洗过滤器。
测定TAMC时,将一个过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂表面。
测定TYMC时,将另一个过滤器移到沙氏-葡萄糖琼脂表面。
大豆酪蛋白消化琼脂在30-35℃培养3-5天,沙氏-葡萄糖琼脂在20-25℃培养5-7天。
计算样品每克或每毫升中的CFU值。
检测贴剂时,过滤在4-5-1描述下制备的样品的10%,分别放入两个无菌过滤器薄膜中。
将一块薄膜放入大豆酪蛋白消化琼脂中测TAMC,将另一块放入沙氏-葡萄糖琼脂中测TYMC。
5-2-2.平皿计数法
5-2-2-1注皿法
按照第四部分描述的合适的方法制备样品。
每个稀释等级的培养基至少准备2个培养皿。
大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30-35℃培养3-5天,沙氏-葡萄糖琼脂培养皿在20-25℃培养5-7天。
根据需要稀释的等级以及TAMC需要显示的最大菌落数为250、TYMC需要显示的最大菌落数为50等来选择培养皿。
用每个培养基的算数平均值来计算每克或每ml样品中的CFU数。
5-2-2-2表面散布法
按照第四部分描述的合适的方法制备样品。
每个稀释等级的培养基至少准备2个培养皿。
培养和计算CFU的方法与注皿法相同。
5-2-3.最大机率法
按照第四部分描述的合适的方法制备样品。
所有试管在30-35℃培养3-5天。
如果需要用合适的程序进行传代培养。
记录每个稀释等级的试管中微生物的生长情况。
根据表2.6.12.-3来确定每克或每ml样品中微生物的最可能数量。
5-3.结果说明
大豆酪蛋白消化琼脂中的CFU数就视为需气菌总数(TAMC);若在此培养基中检测到真菌的菌落,则也可视为TAMC的一部分。
沙氏葡萄糖琼脂中的CFU数就视为酵母菌/霉菌总数(TYMC);若在此培养基中检测到细菌的菌落,则也可视为TYMC的一部分。
当由于细菌的生长致使TYMC超出了可接受标准时,就需要用到含有抗生素的沙氏-葡萄糖琼脂。
用MPN方法计算出的值为TAMC。
微生物质量可接受标准描述如下:
—101CFU:
最大可接受值=20;
—102CFU:
最大可接受值=200;
—103CFU:
最大可接受值=2000,等等。
推荐使用的溶液和培养基在2.6.13中进行介绍。
E.P.2.6.13.
无菌产品微生物检测:
控制菌检测
1.简介
下述的检测方法是用来限制或确定没有按所描述的条件可检测到的控制菌存在。
这些方法最初是用来确定一种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当用作此种目的时,请按下述说明程序进行,包括需要的样品数及按照下述的要求对检测结果进行说明。
其他的微生物程序包括自动的方法,有可能会被用到,这需要证明这些方法等效于药典的方法。
2.一般程序
按照2.6.12.所述准备样品。
如果待测样品有抗菌活性,需要按照2.6.12.的要求除去或中和这种抗菌活性。
如果在准备样品时使用了表面活性剂,那么就需要按照2.6.12.的要求证明这些表面活性剂对微生物是没有毒性的,以及他们与所使用的钝化剂是可以兼容的。
3.培养基的生长促进和抑制特性、检测的适用性及阴性控制
必须证明使用的检测方法能够从待测样品中检测出微生物的存在。
如果检测方法有改变或引入了会影响检测结果的样品,则需要证明方法的适用性。
3.1检测菌株的准备
使用标准化的检测菌株的稳定溶液或用下述的方法对样品进行处理。
使用菌种培养保养技术(菌种系统),以使用于培养的微生物从原始主菌种中移除的片段不大于5个片段,。
3.1.1需氧微生物
用酪蛋白大豆消化肉汤或酪蛋白大豆消化琼脂分别培养每种检测菌株,在
30-35℃培养18-24小时。
用沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤在20-25℃单独培养白色念珠菌菌株2-3天。
—金黄色葡萄球菌,例如ATCC6538、NCIMB9518、CIP4.83或NBRC13276
—绿脓假单胞菌,例如ATCC9027,NCIMB8626、CIP82.118或NBRC13275
—大肠埃希菌,例如ATCC8739,NCIMB8545、CIP53.126或NBRC3972
—鼠伤寒沙门氏菌,例如ATCC14028或Abony沙门氏菌,NBRC100797、NCTC6017、CIP80.39
—白色念珠菌,例如ATCC10231、NCPF3179、IP48.72或NBRC1594
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2的磷酸盐缓冲液制备检测混悬液。
在2小时内使用该混悬液,如果在2-8℃贮存的话,在24小时内使用。
3.1.2梭状芽孢杆菌
用产芽胞梭状芽胞杆菌,例如ATCC11437(NBRC14293,NCIMB12343,CIP100651)或ATCC19404(NCTC532或CIP79.03)或NBRC14293。
在30-35℃无氧条件下,用梭状芽胞杆菌强化培养基培养梭状芽孢杆菌检测菌株24-48小时。
作为一个可供选择的方法,准备及稀释一个新的用作接种的稳定的Cl.sporogenes植物细胞混悬液。
在验证过的周期内这个稳定的混悬液可以在2-8℃保存。
3.2阴性对照
为了证实检测条件,用选定的稀释剂代替样品进行阴性对照,阴性对照必须无微生物生长。
在检测第四部分描述的样品时也需要进行阴性对照。
失败的阴性对照需要进行调查。
3.3培养基的生长促进和抑制特性
测试每一批现成的培养基及每一批用脱水培养基或原料制成的培养基。
照2.6.13.1的描述来验证相关培养基的特性。
液体培养基促生长特性试验:
用适当的培养基接种少量的(不超过100CFU)适当的微生物,在规定温度下培养,培养时间不大于规定的最短培养时间。
清晰可见的微生物的生长情况应与先前用已批准批次的培养基试验所观察到的结果是一致的。
固体培养基促生长特性试验:
用表面分布法,每个培养基接种少量的(不超过100CFU)适当的微生物,在规定温度下培养,培养时间不大于规定的最短培养时间。
清晰可见的微生物的生长情况应与先前用已批准批次的培养基试验所观察到的结果是一致的。
液体或固体培养基生长抑制特性试验:
用适当的培养基接种至少100CFU适当的微生物,在规定的温度下培养,培养时间不少于规定的最长培养时间,应观察不到所测试的微生物的生长情况。
指示特性试验:
用表面展开法用适当的培养基接种少量(不超过100CFU)适当的微生物,在规定的温度下培养在规定范围内的一段时间,菌落的外观及指示反应应与先前用已批准批次的培养基试验得到的结果是一致的。
3.4检测方法的适用性
按照第四部分所描述的相应方法对样品进行处理,混合时在规定的生长培养基内加入测试菌株,分别培养每个测试菌株。
在已接种的测试准备时加入不多于100CFU的微生物。
表2.6.13.1—培养基生长促进、抑制及指示特性
培养基
特性
检测菌株
耐胆汁的革兰氏阴性菌检测
肠道菌浓缩肉汤-莫塞尔
生长促进
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌
生长抑制
金黄色葡萄球菌
紫红胆盐葡萄糖琼脂
生长促进+指示
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌
大肠埃希菌检测
麦康凯肉汤
生长促进
大肠埃希菌
生长抑制
金黄色葡萄球菌
麦康凯琼脂
生长促进+指示
大肠埃希菌
沙门氏菌检测
绿沙门氏菌浓缩肉汤
生长促进
沙门氏菌亚种和
Salmonellaentericasubsp.EntericaserovarAbony
生长抑制
金黄色葡萄球菌
戊醛糖、赖氨酸、脱氧胆酸琼脂
生长促进+指示
沙门氏菌亚种和
Salmonellaentericasubsp.Enteri
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- 微生物 检测 EP