卵巢癌抗独特型疫苗6B11mGM动物体内诱导抗肿瘤免疫应.docx
- 文档编号:629123
- 上传时间:2022-10-11
- 格式:DOCX
- 页数:13
- 大小:27.29KB
卵巢癌抗独特型疫苗6B11mGM动物体内诱导抗肿瘤免疫应.docx
《卵巢癌抗独特型疫苗6B11mGM动物体内诱导抗肿瘤免疫应.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《卵巢癌抗独特型疫苗6B11mGM动物体内诱导抗肿瘤免疫应.docx(13页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
卵巢癌抗独特型疫苗6B11mGM动物体内诱导抗肿瘤免疫应
卵巢癌抗独特型疫苗(6B11mGM)动物体内诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究
卵巢癌抗独特型疫苗(6B11mGM)动物体内诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究
解剖学报2000年第0期第31卷论著
作者:
崔恒 冯捷 昌晓红 叶雪 李艺 曹善津 付天云 姚煜 钱和年 刘蓓
单位:
崔恒冯捷 昌晓红 叶雪 李艺 曹善津 付天云 姚煜(北京大学人民医院妇科肿瘤中心,北京100044);刘蓓(天津市中心妇产科医院实验室,天津300052)
关键词:
卵巢癌;抗体;抗独特型;肿瘤疫苗;动物;实验
【摘要】目的 观察卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(murinegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,mGM-CSF)的融合蛋白(6B11mGM)在小鼠体内诱导抗肿瘤免疫反应情况,探讨此种融合蛋白作为卵巢癌疫苗的可能性及适当的免疫方法。
方法 用融合蛋白6B11mGM免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。
采用间接ELISA及免疫流式方法分析抗血清特征。
结果 经ELISA检测,融合蛋白6B11mGM免疫小鼠后,可诱导机体产生AB3。
同时可刺激小鼠脾脏淋巴细胞CD4+细胞明显升高,CD8+细胞略有升高。
结论 融合蛋白6B11mGM可诱导机体产生特异体液免疫和细胞免疫反应,为抗独特型卵巢癌疫苗用于临床奠定了基础。
【中图分类号】R737.31 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1357(2000)增-101
STUDYOFTHEANTITUMORIMMUNERESPONSESINDUCEDinvivoBYANTI-IDIOTYPICVACCINEOFOVARIANCANCER(6B11mGM)
CUIHeng,FENGJie,CHANGXiao-hong,YEXue,LIYi,CAOShan-jin,FUTian-yun,YAOYu,QIANHe-nian
(GynecologicOncologyCenter,PekingUniversityPeople’Hospital,Beijing100044,China;)
LIUBei
(LaboratoryofCentralObstetricandGynecologicHospital,Tianjin,300052,China)
【Abstrac】ObjectiveToobservewhetherantitumorimmuneresponsecanbeinducedinBALB/cmiceimmunizedwithafusionprotein(6B11mGM)ofanti-idiotypicsinglechainantibody(6B11scFv)andmurinegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)insteadofovariancarcinomaantigen.MethodsBALB/cmicewereimmunizedrepeatedlywith6B11mGM.IndirectELISAtestandimmuneflowcytometerwereusedforanalyzingthecharacterizationofanti-idiotypicScFv(Ab3).ResultsAb3couldbedetectedintheseraofimmunizedmicewith6B11mGMbyELISAtest.Moreover,itstimulatedCD4+TcellfromthespleenofBALB/cmicetoproliferateandCD8+Tcelltoproliferateslightly.Conclusion6B11mGMprobablyinducebothhumoralandcellularimmunityagainstovariancarcinomainvivo.Itillustratedastrongbasicforusingfusionprotein6B11mGMasanti-idiotypevaccinesagainstovariancarcinoma.
【Keywords】Ovariancarcinoma;Antibody/anti-idioype;Tumorvaccine;Animal;Laboratory 本中心采用杂交瘤技术制备出的小鼠内影像型抗独特型抗体6B11,在动物实验已证明可代替卵巢癌相关抗原OC166-9,诱发特异性抗卵巢癌免疫反应[1]。
但是鼠抗独特型抗体,作为疫苗反复应用于人体可诱导人抗鼠抗体(humananti-mouseantibody,HAMA)的产生。
同时抗独特型抗体只模拟少数表位,免疫原性弱,应用时还需要佐剂。
为了降低抗独特型抗体的鼠源性及提高其免疫原性,我们对本中心制备的小鼠内影像型抗独特型抗体6B11进行系列改造,使之更适应临床应用。
首先已成功构建了6B11单链抗体(6B11ScFv)[2],随后又构建了6B11ScFv/人GM-CSF融合蛋白(6B11GM),通过融合蛋白形式,增强了抗独特型抗体的免疫原性,并且体外实验证明可引起以CD4+为主的抗原特异性的T细胞增殖[3],但由于缺乏合适的动物模型,而人GM-CSF和鼠GM-CSF尽管同源性很高[4],结构相似,但它只能与各自相应的受体结合,没有交叉反应,具有绝对的种属特异性,即不能在鼠体内进行融合蛋白作为疫苗的效果和机制的体内实验,限制了进一步基础与临床研究。
因此,构建与融合蛋白6B11GM特性相似,且能在动物体内进行实验的融合蛋白具有重要的意义。
本中心采用基因工程和蛋白质工程技术,在6B11ScFv/hGM-CSF融合蛋白的基础上,构建了卵巢癌抗独特型单链抗体6B11与鼠GM-CSF(6B11ScFv/mGM-CSF)融合蛋白(6B11mGM)[5]。
我们用融合蛋白6B11mGM免疫动物,观察其在动物体内诱导的特异性免疫应答情况,为融合蛋白6B11GM能早日用于临床卵巢癌主动免疫治疗奠定了基础。
材料和方法
1.主要材料与试剂
BALB/c小鼠:
雌性,6~8周,购自北京大学医学部实验动物中心。
辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG,北京中山生物技术有限公司。
异硫氰酸荧光素标记大鼠抗小鼠CD4、CD8:
美国GIBCO公司。
重组鼠GM-CSF纯品(美国RandDSystem)。
福氏完全佐剂(CFA)和不完全佐剂(IFA)(美国Sigma公司)。
2.动物免疫计划
根据本中心以往免疫动物的经验,采用3次免疫方案,第1次为基础免疫,第2、3次为加强免疫。
BALB/c小鼠共分8组,每组6~12只,分别以6B11ScFv、6B11ScFv+鼠GM-CSF、鼠GM-CSF、融合蛋白6B11mGM、6B11ScFV+佐剂、6B11mGM佐剂+佐剂,免疫动物。
以OC166-9(Ag)免疫组为阳性对照,以注射等量PBS的正常鼠为阴性对照。
基础免疫:
各组均采用100μg不同抗原,皮下3点注射(尾根皮下及双后趾底),其中,佐剂组加等量福氏完全佐剂(CFA)。
于免疫后10、14d内眦取血,以间接法ELISA测血清中抗一抗独特型抗体(Ab3),计算3只小鼠的平均值。
第1次加强免疫:
将经基础免疫后的小鼠,于2周后进行第1次加强免疫,各组剂量为50μg,部位同基础免疫。
其中佐剂组加等量福氏不完全佐剂(IFA),于该次免疫后10、14d,检测Ab3,方法同前。
第2次加强免疫:
将经第1次加强免疫后的小鼠,于2周后进行第2次加强免疫,各组剂量为50μg,以水剂腹腔注射,分别于末次免疫后7、14、21、28d处死小鼠,取血、脾,以检测Ab3及小鼠脾细胞的T细胞表型变化。
3.标本制备方法
抗血清的制备:
各次免疫间期,采用内眦取血,每次每组取血3只小鼠,分离血清;末次免疫后,每组每周处死3只小鼠取血,分离血清。
各组免疫小鼠血清分别保存于-20℃,正常鼠为阴性对照,OC166-9(Ag)免疫组为阳性对照。
鼠脾淋巴细胞悬液的制备:
处死小鼠后,立即取脾脏,置0.01mol/LpH7.4PBS中,在平皿中研碎,以7号针头抽吸1次,再经过两次41-2针头,离心,弃掉上清,加3ml三蒸水,溶红细胞30s,立即加入1.8%NaCl,混匀。
1200rpm,离心10min,弃掉上清0.01mol/LpH7.4PBS洗1~2次。
0.2%台盼蓝染色,活细胞计数法计数活细胞比例>95%。
用0.01mol/LpH7.4PBS调整细胞数至所需浓度。
4.融合蛋白6B11mGM诱导特异性体液免疫反应-
Ab3抗血清特性鉴定
采用间接ELISA法检测:
包被卵巢癌抗原OC166-9(2μg/ml),100μl/孔,4℃过夜,PBS-T洗3遍,加含1%BSA的PBS100μl/孔,37℃温育1h,弃孔内液,PBS-T洗3遍后,加以1:
20稀释的不同组免疫鼠抗血清及阴性(PBS)、阳性对照(COC166-9),100μl/孔,37℃温育1h,PBS-T洗3遍后,加1:
1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠lgG,37℃温育1h,PBS-T洗3遍,每次5min,OPD显色,1mol/LH2SO4终止显色反应,测A490值。
5.T细胞表型(CD4、CD8)分析
采用流仪细胞仪(美国BD公司FACSTAR)作T细胞表型分析,标本制备如下:
先在每管加入制备好的鼠脾细胞悬液50μl(1×106细胞),然后加入50μl,FITC标记的大鼠抗小鼠CD4和CD8,摇匀,4℃孵育45min;0.01mol/LpH7.4PBS洗1~2次,1500rpm,离心5min,弃上清;细胞沉淀用80%冷乙醇固定,4℃放置,检测前用PBS洗1次,加300μlPBS吹打悬浮后上机测定。
结 果1.融合蛋白6B11mGM免疫BALB/c小鼠诱发的特异性体液免疫应答
Ab3特性鉴定:
基础免疫后10d与第1次加强免疫后10d,各组鼠血清分别与卵巢癌初始抗原OC166-9结合活性进行比较。
基础免疫后10d获得的各组鼠抗血清,用ELISA检测证明除阳性对照外,各组与卵巢癌初始抗原OC166-9均无明显结合。
第1次加强免疫后10d获得的抗血清,用ELISA检测证明,融合蛋白6B11mGM免疫组Ab3水平明显高于除阳性对照组以外的其他对照组Ab3水平(表1,图1)。
表1 不同免疫原免疫BALB/c鼠诱导产生Ab3水平
Table1 ThelevelsofAb3inducedbydifferentimmunogensinBALB/cmice
第1次加强免疫后10d
10daysafterfirstboosting
基础免疫后10d
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 卵巢癌 独特 疫苗 B11mGM 动物 体内 诱导 肿瘤 免疫