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微生物检验实验室基本要求知识点
病毒是一类体积微小、结构简单、具有严格的寄生于活细胞的微小生物,它们具有下列几种基本特征:
1、病毒的基本结构是由核酸(基因组)与蛋白质组成,由DNA或RNA组成核心,外有一蛋白外壳(核壳),有些病毒在核壳外面另有一层脂蛋白组成的包膜包围着。
2、病毒只在活细胞中增殖,因为病毒缺乏完整细胞器等必要装置,所以必须依赖宿主细胞提供高分子合成装置和能量。
3、病毒非常微小,无细胞结构,绝大多数不能用光学显微镜检查,而必须用电子显微镜才能察见。
核酸化学:
DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。
RNA与DNA差别在核糖2'位带有一个羟基。
DNA①DNA起储存遗传信息作用,并以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。
②由4种核苷酸组成DNA分子,由碱基互补维持DNA双螺旋结构。
③在动植物、细菌、真菌中都含有DNA,但在病毒中(非细胞型微生物)不一定含DNA。
④DNA为长丝状分子互相纠缠,其溶液十分粘稠。
⑤它对紫外线有最强的吸收,通常用260nm波长测DNA溶液浓度,它在近中性环境中带负电核,DNA变性后OD值会升高。
⑥因DNA不溶于乙醇,常用二倍量沉淀DNA
⑦在变性温度时,它的粘性突然降低。
⑧淬火是为了保持DNA单链状态。
DNA变性后溶液慢慢冷却,DNA会自动恢复双螺旋结构。
说法错误的:
(1)DNA和RNA的化学结构碱基G与C通过2对氢键配对构成DNA分子说法错误的。
(2)与DNA分子相比,RNA分子难水解的看法也不对。
(3)许多质粒可在宿主之间进行转移的说法是不对的。
形状:
(1)TRNA二级结构呈三草形。
(2)在细胞内RNA分子中rRNA占比例最大。
(3)DNA二级结构中呈左手双螺旋的是Z构象。
DNA结构、性质:
在真菌中网崎片段一般为100~200核苷酸。
噬菌体核酸最常见的是双链线状DNA。
反式作用因子具有的DNA识别或DNA结合域,主要有螺旋/转折/螺旋(T/H/T),锌指结构,碱性-亮氨酸拉链(bZIP),碱性-螺旋/环/螺旋(bH/L/H)。
真核生物中的瑞粒酶是由RNA和蛋白质构成的。
一般真核生物染色体上有5种主要的组蛋白,其中亲和力最强的两种是H3H4。
DNA的复制和修复:
(1)细胞每分裂一次,染色体DNA就合成一次,新DNA是按原DNA分子合成。
(2)DNA分子拆(ca)开成两条链,依每一条单链合成一条新单链,成为半保留复制。
(3)在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。
(4)DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上,才能顺利开始DNA合成。
(5)在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3,末端的羟基上。
(6)在合成发生错误时,DNA多聚酶会切除错误核苷酸,在那个位置上重新加一个正确核苷酸。
(7)在人工合成DNA时,只加一种或两种三磷酸单核苷酸,那么合成就会停止在缺失的核苷酸位置上。
在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ。
DNA三个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。
在大肠菌中DNA复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅲ。
该酶的核心聚合酶中,具有3,-5,外切酶活性的亚基是逖腔£
在体内染色DNA复制时必须有RNA引物。
在哺(bu)乳动物细胞中负责合成线粒体DNA是DNA聚合酶r。
RNA酶Tl可特异地作用于嘌呤核苷酸3,端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。
体内DNA复制与体外PCR不同的是引发酶参与。
与体内DNA复制不相关酶是反转录酶。
在细胞内DNA合成正常进行是RecA蛋白,而RecA蛋白不具有蛋白酶活性。
在大肠菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段没有5‘-3‘外切酶活性。
DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括Sl核酸酶。
在逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。
在逆转录酶的最终产物双链DNA的长度较正链RNA稍长。
转录:
在生物体内,RNA合成过程称为转录。
它(RNA)是按照储存在DNA上遗传信息合成。
合成RNA时DNA双链也要解旋,解旋部位称启动子。
去掉RNA分子5,末端的磷酸,不起合成酶功能的作用。
在刺激点突变,改变某些基因功能与DNA向RNA转移无直接关系(?
)
(1)大肠菌的RNA聚合酶由5个亚基,其笱腔衅舳幼饔谩£
(2)利福平作用该酶(聚合酶)庋腔稀£
(3)RNA聚合酶Ⅰ主要是转录rRNA(构成核糖体骨架的是rRNA)。
Prt-mRNA内含子的5,-末端一般是GU。
(4)RNA聚合酶Ⅱ主要是转录hnRNA。
在真核基因启动子近侧序列元件中,对转录起点定位起关键作用的是TATA盒。
(5)放线菌素D能抑制DNA转录。
编码核糖体RNA的基因是一种中度重复序列的DNA序列。
翻译:
在合成各种不同RNA中:
(1)tRNA具有搬运氨基酸功能。
构成核糖体骨架的是rRNA。
mRNA直接决定蛋白质的结构。
(2)合成蛋白质需4种核苷酸,排列组成遗传信息,然后转换成20种氨基酸,组成遗传信息称为翻译。
(3)3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码,表示蛋白质合成开始的密码有一种。
(4)在细菌里,依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。
(5)在核糖体上,有两个位置上暴露出mRNA(直接决定蛋白质的结构)分子相邻的两个密码子,当蛋白质合成进行到没有携带任何一种氨基酸tRNA(具有搬运功能)与其对应,这说明合成蛋白质结束,并已开始同一种蛋白质
分子的合成。
(6)合成蛋白质后,决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后,就能自动折叠卷曲成一定的空间形状。
(7)在原核生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA组成,在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中,H1在进化中最不保守。
基因表达调空:
(1)氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。
(2)在基因5,上游基因内或其3,下游序列中存在,能提高同一条DNA链上靶基因转录速率的遗传控制元件是增强子。
(3)乳糖操纵(zong)子中结构基因是LacA、LacY、LacZ。
遗传重组:
转座子的功能有
(1)促进染色体重排
(2)促进基因重复
(3)促进基因扩增
(4)造成缺失突变
在大肠遗传重组中,同源重组需RecA蛋白质。
一、核酸提取、纯化、浓缩
1.用煮沸法从表达内切酶A的大肠菌小量制备质粒时不能省略酚-氯仿抽提。
2.用煮沸法制备质粒所用溶菌酶液是用TrisCL配制的。
3.用乙醇沉淀溶于SDS中RNA时,要避免用乙酸钾。
4.小量制备DNA时不被限制酶切开,应用酚-氯仿抽提。
5.用异丙醇沉淀核酸与用乙醇相比,最明显优点是可减少溶液体积。
1、质粒DNA提取:
在用碱裂解法少量提取质粒DNA时,在缓冲液(Ⅰ液)中不含SDS。
多数质粒在自然状态下是环状链DNA。
质粒DNA纯化方法有:
①离子交换分析;
②聚乙二醇分级沉淀;
③二凝胶过滤层析;
④氯化铯(se)-溴化乙锭梯度平衡离心。
质粒具备有复制起点、抗生素抗性基因、有多种限制酶的单一切点、有较高的拷贝数。
2、NA凝胶电泳:
要使大于2Kb的DNA片段在凝胶电泳中分辨率达最大,其电压不应超过5V/cm。
在电泳中不同构象DNA泳动率通常是:
超螺旋>线性>切口环状。
二、PCR扩增技术:
PCR反应中变性、延伸温度通常是:
95℃、72℃。
引物的Tm值估算每个A或T加2℃。
在PCR反应中每一种dNTP的浓度通常是200umol/L,在PCR反应中经n次循环后理论上,DNA链的扩增数目是2n倍。
在PCR反应中引物只与靶序列的相应部分结合的说法是错误的。
再此(PCR扩增技术)反应中矿物油不是必需的,用于扩增未知序列的PCR是反向PCR。
不对称PCR法专用于制备单链DNA的扩增。
在PCR反应DNA碱基错配率较高,原因是TaqDNA聚合酶缺乏3'-5,外切酶活性。
PCR反应中的引物是DNA。
反应体系中Taq酶过多及引物过多都可引起非靶序列扩增。
三、寡核苷酸探针合成、放射标记、杂交
标记合成寡核苷酸时dNTP的浓度不应低于1umol/L。
探针是一段带标记的单链DNA,双链DNA,cDNA,单链RNA。
杂交液的成分与杂交温度间的关系正确的是甲酰胺42℃,水68℃。
标记探针的最有效简单方法是体外转录法。
标记双链DNA的3,端时,常用T4噬菌体DNA聚合酶,而不是大肠菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段,主要是因为3'-5,外切酶活性高。
Westernblotting所用探针一般是Ab。
Southenblotting一般是用于DNA分子的杂交技术。
在核酸分子杂交技术基础之上又发展了一系列检测DNA和RNA的技术,
如Southenblotting、Westernblotting、Dotblotting和菌落杂交。
大肠菌的DNA聚合酶Ⅰ用在切口平移法标记DNA。
在20℃~25℃下探针与靶序列退火速率最大,比解链温度低情况下进行杂交。
将外源性质粒导入细菌中称为转化。
外源性重组质粒与感受态细菌混在一起,一般在42℃作短暂的热刺激。
cDNA基因克隆以mRNA为模板。
四、基因克隆载体:
柯(ke)斯质粒载体具有噬菌体特性,能通过溶菌周期,形成子代噬菌体颗粒的说法是不对的。
五、DNA序列测定:
与Sanger双脱氧链终止DNA测序法相比,Maxam-Gilbert法所测序列为原DNA分子,这是其特点。
六、克隆子DNA定点诱变:
Mu噬菌体DNA转座成分不含末端反向重复序列。
改变蛋白质密码序列的个别密码子最好采用寡核苷酸介导诱变。
七、研究DNA与蛋白质的方法:
(1)凝胶阻滞试验
(2)DhAsel足迹试验
(3)甲基化干扰试验
(4)体内足迹试验都是研究DNA与蛋白质作用的方法。
病毒是一类体积微小、结构简单、具有严格的寄生于活细胞的微小生物,它们具有下列几种基本特征:
1、病毒的基本结构是由核酸(基因组)与蛋白质组成,由DNA或RNA组成核心,外有一蛋白外壳(核壳),有些病毒在核壳外面另有一层脂蛋白组成的包膜包围着。
2、病毒只在活细胞中增殖,因为病毒缺乏完整细胞器等必要装置,所以必须依赖宿主细胞提供高分子合成装置和能量。
3、病毒非常微小,无细胞结构,绝大多数不能用光学显微镜检查,而必须用电子显微镜才能察见。
核酸化学:
DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。
RNA与DNA差别在核糖2'位带有一个羟基。
DNA①DNA起储存遗传信息作用,并以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。
②由4种核苷酸组成DNA分子,由碱基互补维持DNA双螺旋结构。
③在动植物、细菌、真菌中都含有DNA,但在病毒中(非细胞型微生物)不一定含DNA。
④DNA为长丝状分子互相纠缠,其溶液十分粘稠。
⑤它对紫外线有最强的吸收,通常用260nm波长测DNA溶液浓度,它在近中性环境中带负电核,DNA变性后OD值会升高。
⑥因DNA不溶于乙醇,常用二倍量沉淀DNA
⑦在变性温度时,它的粘性突然降低。
⑧淬火是为了保持DNA单链状态。
DNA变性后溶液慢慢冷却,DNA会自动恢复双螺旋结构。
说法错误的:
(1)DNA和RNA的化学结构碱基G与C通过2对氢键配对构成DNA分子说法错误的。
(2)与DNA分子相比,RNA分子难水解的看法也不对。
(3)许多质粒可在宿主之间进行转移的说法是不对的。
形状:
(1)TRNA二级结构呈三草形。
(2)在细胞内RNA分子中rRNA占比例最大。
(3)DNA二级结构中呈左手双螺旋的是Z构象。
DNA结构、性质:
在真菌中网崎片段一般为100~200核苷酸。
噬菌体核酸最常见的是双链线状DNA。
反式作用因子具有的DN
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