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课程论文

齐齐哈尔大学

课程设计（论文）

题目果胶裂解酶特性研究

学院食品与生物工程学院

专业班级生物工程091班

学生姓名冯文宇

指导教师田英华

2012年12月21日

摘要

果胶裂解酶（pectinlyases，PNL，E．C．4．2．2.10）是果胶降解过程中的重要酶系，它通过β一消旋的方式作用于半乳糖醛酸第5位的β碳原子，使β一碳原子上的H转移到了糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C4和C5之间形成双键，产生半乳糖醛酸寡聚糖。

PNL是唯一通过反式消去作用降解高酯化程度果胶物质的果胶酶，而不需要果胶酯酶的酯化作用，在工业上具有广泛的应用，尤其在在果汁果酒的澄清与产汁和纺织造纸行业的麻料脱胶工艺。

果胶裂解酶（Pectinlyase）为常用的食品用酶制剂，其来源主要是黑曲霉Aspergillusniger在严格控制的条件下进行液体深层发酵制备而成，且其性状为棕色液体，产品颜色随批次不同略有不同。

关键词：

果胶裂解酶，OD值，活性，最适条件

第1章绪论

1.1果胶裂解酶的用途

在果汁加工技术中，酶起着十分重要的作用。

在苹果汁和浆果汁的生产中使用果胶酶和淀粉酶已经有60多年的历史了。

传统的果胶酶是将果胶结构完全降解，果胶裂解酶不必降解过多的细胞壁物质，通过β一消旋的方式作用于半乳糖醛酸第5位的β碳原子，使β一碳原子上的H转移到了糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C4和C5之间形成双键，产生半乳糖醛酸寡聚糖，它将赋予更多的控制，是专一的反应。

果胶裂解酶是果胶降解过程中的重要酶系，是唯一通过反式消去作用降解高酯化程度果胶物质的果胶酶，而不需要果胶酯酶的酯化作用，在工业上具有广泛的应用，尤其在在果汁果酒的澄清与产汁和纺织造纸行业的麻料脱胶工艺。

，

1.2果胶裂解酶基本性质研究的基本方法

　取2·0mL0·5%果胶溶液于试管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL待测酶液,40℃保温10min。

取上述反应混合物0·5mL,加入4·5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应。

相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值,不饱和双键的摩尔吸光系数为5200。

将每分钟分解果胶,使235nm处消光值增加1·0的酶量定义为1单位果胶裂解酶（PL）酶活。

1.2.1不同浓度果胶裂解酶的活性的测定

取2·0mL0·5%果胶溶液于试管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液,40℃保温10min。

向反应混合物中加入22.5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值。

1.2.2不同pH果胶裂解酶的活性的测定

取2·0mL0·5%不同pH的果胶溶液于试管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）,40℃保温10min。

向反应混合物中加入22.5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值。

1.2.3不同保温时间果胶裂解酶的活性的测定

取2·0mL0·5%果胶溶液于试管中,40℃、45℃、50℃等不同温度下水浴平衡5min,加入0·5mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）,40℃、45℃、50℃等不同温度下保温10min。

向反应混合物中加入22.5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值。

材料和方法

2.1酶液

实验室新进果胶裂解酶

2.2主要试剂及器材

电子天平上海精科

隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器厂

DL102电热鼓风干燥箱天津市实验仪器厂

压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂

超净工作台苏州净化设备股份公司

UV-120-02紫外分光光度计日本岛津

pH计PB-10赛多丽丝科学仪器有限公司

蒸馏水市售

试管架、比色管、石英比色皿等实验室自有设备

2.3溶液的配制

2.3.10.5%果胶溶液

0.2M,不同pH醋酸-醋酸钠缓冲液配制

2.3.2pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：

甲液：

0.2mol/L醋酸6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升

乙液：

0.2mol/L醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O

分别吸取甲液82.0mL，乙液18.0mL

2.3.3pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：

甲液：

0.2mol/L醋酸6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升

乙液：

0.2mol/L醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O

分别吸取甲液63.0mL，乙液37.0mL

2.3.4pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：

甲液：

0.2mol/L醋酸6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升

乙液：

0.2mol/L醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O

分别吸取甲液41.0mL，乙液59.0mL

2.3.5pH5.2醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：

甲液：

0.2mol/L醋酸6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升

乙液：

0.2mol/L醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O

分别吸取甲液21.0mL，乙液79.0mL

注意：

醋酸易挥发，有腐蚀性，应用保鲜膜密封，且应用pH计对缓冲液pH进行校对。

2.4、实验方法

2.4.1不同酶浓度影响的测定方法

①不同浓度酶液的稀释

分别在50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml容量瓶中取1mL的原酶液，定容，即为稀释后的酶液。

②恒温

分别吸取2·0mL0·5%pH4.0的果胶溶液于25ml比色管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液,40℃保温10min，做三组平行样。

③空白

取一只比色管加入0.5mL稀释后的酶液加入22.5ml0·05mol/L的HCl充分摇匀后加入2mL果胶溶液，与其它比色管一起水浴保温。

④定容

分别向每支管中加0·05mol/L的HCl使其定容到25mL。

盖上比色管管塞，混匀。

⑤测OD值

在235nm下，以灭活管调零，用721型分光光度计测其他管管的果胶溶液的OD值。

2.4.2不同pH的底物影响的测定方法

①取1000倍稀释的酶液

在1000ml容量瓶中取1mL的原酶液，定容至1000ml，即为待测的酶液。

②恒温

分别吸取2·0mL0·5%pH4.0、pH4.4、pH4.8、pH5.2的果胶溶液于25ml比色管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL果胶裂解酶待测酶液,40℃保温10min，做三组平行样。

③空白

取一只比色管加入0.5mL稀释后的酶液加入22.5ml0·05mol/L的HCl充分摇匀后加入2mL果胶溶液，与其它比色管一起水浴保温。

④定容

分别向每支管中加0·05mol/L的HCl使其定容到25mL。

盖上比色管管塞，混匀。

⑤测OD值

在235nm下，以灭活管调零，用721型分光光度计测其他管管的果胶溶液的OD值。

2.4.3不同保温时间影响的测定方法

①取1000倍稀释的酶液

在1000ml容量瓶中取1mL的原酶液，定容至1000ml，即为待测的酶液。

②恒温

分别吸取2·0mL0·5%pH4.0的果胶溶液于25ml比色管中,40℃、45℃、50℃等不同温度下水浴平衡5min,加入0·5mL果胶裂解酶待测酶液,40℃、45℃、50℃等不同温度下保温10min，做三组平行样。

③空白

取一只比色管加入0.5mL稀释后的酶液加入22.5ml0·05mol/L的HCl充分摇匀后加入2mL果胶溶液，与其它比色管一起水浴保温。

④定容

分别向每支管中加0·05mol/L的HCl使其定容到25mL。

盖上比色管管塞，混匀。

⑤测OD值

在235nm下，以灭活管调零，用721型分光光度计测其他管管的果胶溶液的OD值。

2.4.4.酶活的测定：

果胶裂解酶活力的测定：

取2.0ml0.5%pH4.0的果胶溶液，放入25ml比色管中，将溶液在40oC条件下恒温水浴中加热5min，在加入0.5ml果胶裂解酶溶液混合，然后在40oC条件下恒温水浴中反应10min，反应后立即加入22.5ml0·05mol/L的HCl，即定容至25mL，摇匀，充分终止酶反应，在235nm波长下测定吸光度值。

酶活计算公式：

酶活力（U/mL）=（A235/b·ε235）×N×25×103

=48.077•A•N/b=48.077•A•N

其中：

A235—为溶液的吸光光度值；

b—为比色皿厚度（cm）；

ε235—为235nm下，不饱和半乳糖醛酸的摩尔吸光系数,即5200（cm-1•M-1）；

N—为酶液的稀释倍数

②酶活力单位：

pH4.0，40oC每分钟水解果胶，使235nm处的消光值增加0.1的酶量定义为1单位果胶裂解酶（PL）酶活。

第3章结果和讨论

3．1不同酶浓度影响的测定方法

取17支25mL的比色管，编号，分别按下表加入各种试剂：

表4-1不同酶浓度影响的测定方法

稀释倍数

组号

HCl（ml）

果胶裂解酶溶液（ml）

0.5%果胶溶液（ml）

OD值

空白

22.500

0.500

2.000

0.000

50倍稀释

1

22.500

0.500

2.000

0.357

2

22.500

0.500

2.000

0.353

3

22.500

0.500

2.000

0.348

100倍稀释

1

22.500

0.500

2.000

0.337

2

22.500

0.500

2.000

0.332

3

22.500

0.500

2.000

0.329

200倍稀释

1

22.500

0.500

2.000

0.321

2

22.500

0.500

2.000

0.326

3

22.500

0.500

2.000

0.329

500倍稀释

1

22.500

0.500

2.000

0.260

2

22.500

0.500

2.000

0.267

3

22.500

0.500

2.000

0.263

1000倍稀释

1

22.500

0.500

2.000

0.274

2

22.500

0.500

2.000

0.275

3

22.500

0.500

2.000

0.272

取2·0mL0·5%果胶溶液于试管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液,40℃保温10min。

向反应混合物中加入22.5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值,根据OD值，测定酶活力。

稀释倍数

OD值

酶活力

空白

0.000

0.000

50倍稀释

0.357

858.174

0.353

848.559

0.348

836.540

100倍稀释

0.337

1620.195

0.332

1596.156

0.329

1581.733

200倍稀释

0.321

3086.543

0.326

3134.620

0.329

3163.467

500倍稀释

0.260

6250.010

0.267

6418.279

0.263

6322.125

1000倍稀释

0.274

13173.098

0.275

13221.175

0.272

13057.904

3．2不同pH果胶裂解酶的活性的测定

取13支25mL的比色管，编号，分别按下表加入各种试剂：

表4-2不同pH果胶裂解酶的活性的测定

pH

组号

HCl（ml）

果胶裂解酶溶液（ml）

0.5%果胶溶液（ml）

OD值

空白

22.500

0.500

2.000

0.000

4

1

22.500

0.500

2.000

0.186

2

22.500

0.500

2.000

0.187

3

22.500

0.500

2.000

0.184

4.4

1

22.500

0.500

2.000

0.288

2

22.500

0.500

2.000

0.281

3

22.500

0.500

2.000

0.290

4.8

1

22.500

0.500

2.000

0.234

2

22.500

0.500

2.000

0.230

3

22.500

0.500

2.000

0.260

5.2

1

22.500

0.500

2.000

0.340

2

22.500

0.500

2.000

0.350

3

22.500

0.500

2.000

0.334

取2·0mL0·5%不同pH的果胶溶液于试管中,40℃水浴平衡5min,加入0·5mL果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）,40℃保温10min。

向反应混合物中加入22.5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值，根据OD值，测定酶活力。

pH

OD值

酶活力

空白

0.000

0.000

4

0.186

8942.322

0.187

8990.399

0.184

8846.168

4.4

0.288

13846.176

0.281

13509.637

0.290

13942.330

4.8

0.234

11250.018

0.230

11057.710

0.260

12500.020

5.2

0.340

16346.180

0.350

16826.950

0.334

16057.718

3．3不同保温时间果胶裂解酶的活性的测定

取13支25mL的比色管，编号，分别按下表加入各种试剂：

表4-3不同保温时间果胶裂解酶的活性的测定

温度

组号

HCl（ml）

果胶裂解酶溶液（ml）

0.5%果胶溶液（ml）

OD值

空白

22.500

0.500

2.000

0.000

40

1

22.500

0.500

2.000

0.121

2

22.500

0.500

2.000

0.13

3

22.500

0.500

2.000

0.149

45

1

22.500

0.500

2.000

0.172

2

22.500

0.500

2.000

0.172

3

22.500

0.500

2.000

0.188

50

1

22.500

0.500

2.000

0.255

2

22.500

0.500

2.000

0.256

3

22.500

0.500

2.000

0.259

55

1

22.500

0.500

2.000

0.259

2

22.500

0.500

2.000

0.265

3

22.500

0.500

2.000

0.281

取2·0mL0·5%果胶溶液于试管中,40℃、45℃、50℃等不同温度下水浴平衡5min,加入0·5mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）,40℃、45℃、50℃等不同温度下保温10min。

向反应混合物中加入22.5mL0·05mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值，根据OD值，测定酶活力。

温度

OD值

酶活力

空白

0.000

0.000

40

0.121

5817.317

0.130

6250.010

0.149

7163.473

45

0.172

8269.244

0.172

8269.244

0.188

9038.476

50

0.255

12259.635

0.256

12307.712

0.259

12451.943

55

0.259

12451.943

0.265

12740.405

0.281

13509.637

3．4结果讨论

1．果胶裂解酶的活性受多种因素影响，主要有pH，温度，酶浓度等几方面，经试验，当酶稀释到1000倍时，酶活力仍存在，且不断上升；其原因，可能是由于稀释酶与果胶底物接触充分，反映效果好。

2.通过对比研究表明，果胶裂解酶在pH4.0是有平稳且较好的效果，随pH的增高，波动加大。

3.通过对温度的对比研究表明，酶在50℃时，有平稳且较高的活性，超过50℃，活性变化不大。

4.通过多次实验发现，酶液的保存条件，保存温度及保存时间对酶液活性具有负向影响；反应的预热时间及反应时间的长短对酶反应也有影响；所用灭活的HCl浓度对酶反应影响不大。

致谢

本论文的实验过程和论文修正均是在田英华老师的悉心指导和直接参与下完成的。

田老师的细心讲解，敏捷的思维，丰富的经验和对待学生认真负责的态度，都给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。

在实验过程中我的动手操作能力和理论水平都有了很大程度的提高。

衷心感谢田英华老师，在此致以诚挚的谢意！

同时，感谢我的同学马华东和张佳丽的帮助与支持！

参考文献

[1]医学百科

[2]XX百科

[3]俞中《果胶裂解酶_果蔬汁加工行业的一次新技术革命》（诺维信（中国）投资有限公司，北京100085）

[4]柯崇榕，杨欣伟，林晓华，吴毕莎，陈荣珠，黄建忠《黑曲霉果胶裂解酶的生物信息分析》（福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建省现代发酵技术工程研究中心，福建福州350108）

[5]汤鸣强《黑曲霉产果胶酶的分离纯化和酶学特性研究》（福建师范大学2004）

[6]赵政董云舟堵国成陈坚《碱性果胶裂解酶摇瓶发酵条件的研究》（《工业微生物》-2003,33）

[7]王小敏吴文龙闾连飞李维林屈乐文《分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究》（江苏省中国科学院植物研究院210014）

[8]李忠福徐建国《分光光度法测定果胶酶活性方法的研究》（哈尔滨制药总厂150086）

[9]丁凤平张秀芝《碱性果胶酶PATE及其测定方法》（南京生物化学制药研究所）