体外分析.ppt
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体外放射分析法,类型,一、竞争性分析:
放射免疫分析法(RIA),标记抗原,二、非竞争性分析:
免疫放射分析法(IRMA),标记抗体,放射免疫分析,一、基本原理:
限量标记抗原(*Ag)和可变量的待测的非标记抗原(Ag)与定量的特异性抗体(Ab)发生竞争结合反应,通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的含量。
放射免疫分析标准曲线常用的三种作图法,二、RIA,试剂盒的必备条件:
1、抗体:
多克隆抗体与单克隆抗体,理想的抗体:
高亲和力、高特异性、高滴度,放射免疫分析技术所用抗体质量的三种主要指标,亲和力测定,交叉反应测定,滴度的检测,
(1)亲和力
(2)交叉反应(3)滴度检测:
大分子抗原125I小分子3H或接一个大分子蛋白质,常用牛血清白蛋白,再125I标记125I标记:
每个蛋白分子小于1个125I原子3H标记:
每个蛋白分子可14个3H原子,2、标记抗原:
标记率、比活度放化纯T1/2不能太短:
125I59.7天3H不改变原有抗原特性(特异性、亲和力、免疫活性等),3、标准品或校准试剂:
4、质控样品:
标准品是定量的依据,要求纯度尽量高,配制时浓度要准确。
免疫活性与待测抗原相一致(平行试验),高、中、低三种;质控标本为血清,用PBS稀释,是提纯抗原;用“0”血清稀释,“0”血清可用混合血清;用活性炭等处理;,
(1)液相分离剂:
a、双抗体沉淀法;b、PEG沉淀法;c、葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法;d、活性炭吸附法:
测上清液e、微孔滤膜过滤法f、其它:
如盐析法、层析法、电泳法等,5、分离试剂和材料:
(2)固相分离剂:
材料:
如塑料、纤维等,凝胶颗粒等具备条件:
a、吸附牢固;b、不影响抗体免疫活性;c、NSB低;d、吸附材料的理化性质稳定;e、吸附材料价廉易得;,三、测定方法,1、加样:
(1)经典加样法;
(2)顺序加样法:
Ab+待测Ag*Ag测小分子抗原可提高灵敏度,但稳定性、重复性较差2、孵育:
3、分离结合与游离部分:
4、测放射性:
5、数据处理:
四、评估RIA试剂盒的主要技术指标,1、灵敏度:
该试剂盒的最低检测值RIA:
0管的结合率-2SDIRMA:
0管的结合率+2SD2、准确度:
指样品测定值偏离真值的程度回收试验:
95105%,3、精密度:
同一样品重复测定的实测剂量的离散程度CV=SD/均数100%批内10%;批间15%ABCV:
一批试验的平均CV(为各样品CV的平均值,如两批样品的含量一高一低,ABCV就缺乏可比性,就必须作精密度图:
4、特异性:
主要指抗体的特异性5、非特异结合率:
PEG10%双抗或固相5%6、剂量-反应曲线和工作范围:
改变抗体滴度对标准曲线不同区段斜率(A)及精密度图(B)的影响,五、RIA的质控,1、目的:
质控是对分析工作的误差进行经常性检查,遇到有质量异常则及时采取对策,以保证分析误差控制在可接受的范围内(QC)。
2、内容:
试验误差:
随机误差和系统误差
(1)标准曲线质量;
(2)精密度检验;(3)整批试验的偏差;(4)漂移;(5)批间质控;,精密度、偏差和准确度三者关系示意图,Schewart图,Cusum图,其他放射免疫分析,放射受体分析法;放射竞争蛋白结合分析法;放射酶分析法;,免疫放射分析,一、基本原理:
免疫放射分析法(IRMA)是用过量的放射性核素标记的抗体(*Ab)和限量的抗原或半抗原(Ag)结合,形成Ag*Ab、其放射性和所加Ag的量呈正相关。
二、IRMA的特点:
1、属于非竞争性抗原抗体结合反应;2、抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原量呈正相关;3、在低剂量区不会有不确定因素,灵敏度较高;4、IRMA的NSB对低剂量区影响大;5、RIA低剂量区的放射性高,NSB主要影响高剂量区,IRMA相反,影响低剂量区;,三、IRMA的试剂:
1、标记抗体;通常是单克隆抗体。
2、标准品;3、分离试剂:
固相抗体4、质控;,四、IRMA的基本方法:
1、双抗体夹心法:
Ab1Ag*Ab22、标记第三抗体法:
Ab1AgAb2*抗Ab23、生物素标记抗体:
Ab1Ag生物素标记Ab2125I标记亲和素,特点:
每一抗体分子可以连接几十个分子生物素,提高灵敏度。
五、IRMA的实际应用中的特点:
1、标记物的稳定性:
标记抗体2、反应动力学:
标记抗体过量,反应容易达到平衡3、分析灵敏度:
高,4、可测量的剂量范围宽;,IRMA和RIA精密度图的比较,5、特异性高;两个抗体6、加样误差小;关键是Ag,五、IRMA的不足之处:
两株抗体,针对不同抗原决定簇,要求被测抗原至少有1216个氨基酸组成有特征性的序列(68个氨基酸决定一个抗原决定簇)。
主要测定肽类和蛋白质,半抗原不能应用。
非放射性标记免疫分析,优点:
1、有些技术能提高灵敏度和稳定性;2、反应迅速,缩短测定时间,提高工作效率;3、能执行全自动化;4、减少误差,提高质控水平;5、有效半衰期较长;6、从免疫分析的角度说,非放射性与放射性分析技术的原理是相同的,只是以酶、荧光、发光等代替125I,最后信号不是放射线而是其他物理形式。
一、酶标记免疫分析法:
固相Ab1Ag酶标记Ab,作用于酶底物,产生光吸收物质、荧光物质或化学发光。
1、酶联免疫吸附分析法(ELISA),原理:
在抗体分子上连接酶分子,代替放射性标记的抗体,进行与IRMA相似的夹心免疫反应。
反应结束后,分离结合、游离部分,取结合部分,利用酶的催化活性,由结合部分上的酶将特定的底物转化为特定的颜色,颜色的深浅与酶的量呈正比。
2、酶免疫荧光分析法,将酶反应的底物改为荧光物质光子激发荧光,二、发光免疫分析法:
采用化学发光物质作为标记物,化学发光免疫分析(CLIA),酶增强发光免疫分析(ECLEA),电化学发光免疫分析(ECLIA),1、化学发光免疫分析法(CLIA),原理:
发光物质标记抗原或抗体,标记的发光物质通过氢化反应获得能量,处于激发态,当其返回基态时以光子形式释放能量,其发光强度与被测物质浓度相关。
固相Ab1待测Ag化学发光物质标记Ab,氧化等反应发生化学反应光子。
发光物质:
1、异鲁米诺;2、丫啶酯类;3、苯酚类;4、咪唑类;5、苯基草酸酯类,2、酶增强发光免疫分析法(ECLEA),原理:
将化学发光物质作为酶的发光底物,由酶触发化学发光物质激发过程,产生光子。
酶:
1、辣根过氧化酶系统;2、碱性磷酸酶系统;,以DPC公司为例:
AMPPD,中间体,减去一个磷酸基,裂解,金刚烷酮,间氧苯酯阴离子(激发态),基态,光子,3、电化学发光免疫分析法(ECLIA),原理:
是一种在电极表面由电化学引起的发光反应。
三联吡啶钌+三丙胺(TPA),电场阳极面,氧化反应(失去一个电子),TPA氧化成阳离子自由基,失去一个质子,形成一种强还原剂,三价三联吡啶钌,二价(强氧化剂),激发态,光子,*三联吡啶钌无消耗,仅消耗TPA,三、荧光免疫分析法:
该反应系统不使用酶,而用荧光物质标记抗原或抗体进行分析。
1、荧光偏振分析技术(FPIA);2、时间分辨荧光免疫分析技术(TrFIA);,铕(Eu)标记抗体+待测Ag形成复合物,酸性条件下,Eu荧光弱信号,增强液-二酮体,新的螯合物,持续且强的荧光信号,在此反应中,自然本底荧光衰变410ns,而Eu3+的荧光衰变为4.3105ns,RIA与化学发光的比较,RIA存在以下不足:
1、标记物的稳定性;2、反应时间过长;3、放射性计数有自身涨落;4、人工操作存在误差;5、不能进行全自动化操作;6、药盒有效期短;,化学发光的优点:
1、非放射性分析;2、灵敏度高;3、稳定性好;4、检测速度快;5、全自动化;6、半衰期长;,受体放射配基结合分析,一、基本原理:
用放射性核素标记配基与相应的受体进行特异性结合,测定复合物的放射性活度,从而对受体进行定性和定量。
R为游离受体;L为游离配基的浓度RL为复合物浓度K1为结合速率常数,k2为解离速率常数,1、饱和曲线:
2、竞争抑制曲线:
若受体和放射性配基的结合反应系统中另加入该受体的非标记配基,则后者会与放射性配基竞争受体,一、基本条件:
1、受体标本:
(1)分离亚细胞组分;
(2)完整的活细胞;(3)组织切片;2、标记配基:
(1)高比活度;
(2)高亲和力;(3)高特异性;(4)高放化纯度;,3、非标记配基:
(1)测NSB;
(2)竞争结合反应中作为竞争剂;4、结合反应类型:
(1)多点饱和曲线;
(2)单点法;5、反应的环境条件:
(1)PH、Buffer;
(2)温育温度和时间;(3)反应体积;6、分离结合和游离部分:
临床意义:
1、内分泌系统:
(1)甲状腺激素:
T3、T4、FT3、FT4、TSH、TGAb、TMAb、TPOAb、Tg、TRAb;
(2)糖尿病:
胰高糖素、胰岛素、C肽、生长抑素、IAb、IcAb、GAD;(3)肾上腺:
皮质醇、ACTH;(4)生殖系统:
FSH、LH、T、P、E2、PRL、HCG、-HCG;2、垂体系统:
ACTH、TSH、LH、FSH、PRL、HGH、ADH、,3、心血管系统:
肾素、血管紧张素、醛固酮、胆红蛋白、心肌钙蛋白、地高辛、心纳素、内皮素4、肿瘤标志物:
AFP、CEA、Ca50、Ca199、Ca125、Ca153、Ca724、PSA、FPSA、Ca211、NSE、Scc、TPS、TSGF、,要点:
一、医师:
1、熟练掌握:
(1)体外放射分析(竞争性分析、非竞争性分析);
(2)RIA基本原理和特点;(3)放射免疫分析的质量控制;2、掌握:
(1)放射分析的基本技术要求:
a、配体;b、特异性结合剂;c、分离技术;d、生物素和亲和素的应用;e、生物样品的制备;f、标准曲线的拟合方式;
(2)临床意义:
内分泌系统(3)放免与非放比较:
包括化学发光、时间分辨荧光等;,二、技师:
1、熟练掌握:
(1)体外放射分析中的竞争性分析;
(2)RIA基本原理和特点;2、掌握:
(1)放射分析的基本技术要求中的配体;
(2)临床意义:
内分泌系统,
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