玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用.docx
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玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用
玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用
【摘要】目的研究玉郎伞多糖(YLS)对H2O2诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机理。
方法采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用H2O2体外诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中AST和ALT水平,测定肝细胞中MDA和GSH含量,MTT法检测细胞存活和增殖活性。
结果YLS可明显降低或恢复由H2O2升高的培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞中MDA含量,还可提高H2O2降低的肝细胞存活率和GSH含量。
结论提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。
【关键词】玉郎伞多糖;肝细胞;过氧化氢;抗氧化作用
Abstract:
ObjectiveTostudytheprotectiveeffectanditsmechanismofYulangsanpolysaccharide(YLS)onprimaryculturedrathepatocytesinjuryinducedbyH2O2.MethodsTheprimaryrathepatocyteswereisolatedbyperfusionwithIVcollaganaseandinjuredbyH2O2.Thecontentsofmalondialdehyde(MDA)andglutathion(GSH)inhepatocytesandthelevelsofASTandALTinculturalsupernatantweredeterminedbygeneralmethods.CellviabilitywasassayedbyMTTmethod.ResultsTheelevationofMDAcontentinhepatocytesandASTandALTlevelsinsupernatantofculturalhepatocytes,andthedecreaseincellviabilityandGSHcontentinducedbyH2O2wererestoredremarkablybythetreatmentwithYLS.ConclusionTheresultssuggestthatYLSpossessesdirectprotectiveactiononprimaryhepatocyteinjuryinducedbyH2O2.Thismightbeassociatedwiththeanti-oxidativeactivityofYLS.
Keywords:
YulangsanPolysaccharide(YLS);Hepatocyte;H2O2;Anti-oxidativeactivity
玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药,为蝶型花科植物疏叶岩豆MillettiapulchraKurzvar.laxior(Dunn)ZWei的块根。
具有散淤、消肿止痛之功能,民间用于高血压、肝炎、消化不良等的治疗,本课题组经多年研究证实玉郎伞提取物具有抗氧化和免疫调节作用,并对急、慢性实验性肝损伤均有明显的保护作用[1,2]。
玉郎伞多糖是玉郎伞提取物中主要的有效成分,为进一步研究YLS对肝损伤的作用,本文采用IV型胶原酶灌流法分离肝实质细胞进行体外培养,用过氧化氢(H2O2)诱导肝细胞损伤模型进行体外研究,观察YLS对体外肝细胞损伤的保护作用及其机制。
1器材
动物Wistar大鼠,雌雄不拘,体重(230±30)g;由广西医科大学实验动物中心提供。
实验动物生产许可证:
SCXK桂20030003,实验动物使用许可证:
SYXK桂20030005。
药物及试剂YLS,由本室自行提取;IV型胶原酶(Sigma公司);RPMI1640(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);H2O2(重庆川江化学试剂厂);维生素E(Sigma公司);台盼蓝(SigmaT6146,北京拜尔迪生物公司分装);噻唑蓝;DHanks缓冲液;Hanks缓冲液;二甲基亚砜;天门冬氨酸转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)试剂盒;丙二醛(MDA)试剂盒;谷胱甘肽(GSH)试剂盒。
仪器HL2型恒流泵;CO2恒温培养箱;TDL802B台式离心机;XD-101倒置显微镜;SZX型超净工作台;722s型可见分光光度计;450型酶标仪。
2方法
大鼠原代肝细胞的分离及原代培养[3,4]大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉后,固定四肢,腹部消毒后,无菌操作下,打开腹腔,将肠管推向左侧,暴露门静脉和下腔静脉,小心分离穿线各一根,门静脉穿刺静脉留置针,退出针芯,结扎牢固。
将留置管连接输液管,开启恒流泵,灌流37℃预热DHank‘s液,流速15ml/min,迅速剪开下腔静脉放血。
同时打开胸腔暴露并结扎上腔静脉。
灌流约10min后,肝脏颜色呈黄白色。
下腔静脉插入硅胶管,结扎牢固。
改用含%IV型胶原酶的Hanks液15ml/min,约15min后,肝脏软化,压之凹陷不易恢复,迅速取下完整肝脏,连同含胶原酶灌流液置于平皿中,剔除肝包膜,轻柔摆动肝组织,让细胞慢慢游离出来,200目筛过滤得细胞悬液。
600r/min离心,弃上清,沉淀加1640培养液吹打混匀,800r/min离心,共洗涤两次。
用血球计数板测定细胞活率及细胞密度。
用1640培养液调整细胞密度为5×105/ml,肝细胞活力大于90%。
将上述肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中培养12h后,肝细胞全部贴壁生长,供试验用。
YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用[5,6]维生素E作阳性对照,用少量DMSO溶解,加入到培养液后其终浓度为50μmol/ml。
取上述贴壁生长的肝细胞,设H2O2模型组、YLSmg/ml4个剂量组和空白对照组、维生素E组,每组至少设6个复孔。
分别加入H2O2 mmol/L,不同浓度的YLS,维生素E和溶媒,继续培养24h后,收集培养上清检测AST,ALT活性;弃肝细胞培养上清,加入mlTriton-100水溶液ml,混匀,2500r/min离心10min,取上清测定肝细胞MDA和GSH含量,同时用MTT比色法,测定肝细胞的活率。
MTT比色法待测细胞悬液于96孔培养板培养24h后,各孔加入20μlMTT试剂,轻轻混匀,继续37℃培养4h,吸出全部液体,加200μlDMSO,微量振荡器上振荡15min,待溶解完全,于酶标仪570nm波长比色。
赖氏法测定AST和ALT按试剂盒说明测定。
MDA和GSH含量测定按试剂盒说明测定。
数据处理所有数据均以±s表示,采用t检验进行统计处理。
3结果
结果见表1。
YLS对H2O2损伤肝细胞ALT和AST活性的影响H2O2损伤肝细胞后,促进肝细胞内酶的释放,模型组的ALT,AST水平较正常组明显升高,YLS在mg/ml剂量范围内,能显着抑制H2O2损伤肝细胞后ALT,AST水平的上升,并呈明显的剂量依赖性;VitE也能明显抑制H2O2损伤肝细胞后ALT,AST水平的上升。
YLS对H2O2损伤肝细胞MDA和GSH的影响H2O2损伤肝细胞后,肝细胞中的MDA明显升高,GSH则显着降低,除mg/ml外,其余YLS各剂量组均能显着提高H2O2损伤肝细胞中的GSH含量和降低H2O2损伤肝细胞中的MDA含量,并呈明显的剂量依赖性;VitE对H2O2损伤肝细胞也具有提高GSH含量和降低MDA含量的作用。
YLS对H2O2损伤肝细胞活性的影响MTT法测定结果表明,H2O2损伤后模型组细胞活性明显下降,YLS在mg/ml剂量范围内,能显着恢复和升高H2O2损伤肝细胞后的细胞活性,并呈明显的剂量依赖性;VitE也能恢复和升高H2O2损伤肝细胞后的细胞活性。
表1YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用
与H2O2组比较,*,**,与对照组比较,Δ,ΔΔ;n=6
4讨论
在肝细胞损伤过程中,氧自由基起了重要作用。
OFR及其诱发的脂质过氧化物(LPO)可引起激烈的链式反应,产生几十种毒性分子,再次诱发成
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- 玉郎伞 多糖 过氧化氢 诱导 大鼠 肝细胞 损伤 保护 作用