11第五章农药残留的酶与免疫测定技术.docx

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11第五章农药残留的酶与免疫测定技术

第五章农药残留的酶与免疫测定技术

随着生命科学、环境科学、新材料等科学的发展，以及生物学、信息科学、计算机技术的引入，使分析化学进入新的境界，如分析研究对象越来越多的选择了DNA、蛋白质、手性药物和环境毒物等与生命活动相关的物质；分析研究体系由简单转向复杂体系；分析研究层次已进入了单细胞、单分子水平和立体构象，分析研究方法除发展各类仪器分析手段之外，开始较多的研究酶和免疫学等生物化学方法。

农药残留分析领域的发展趋势无疑与整个分析化学的发展趋势相一致。

为适应市场的需求，满足贸易的时效，保护消费者健康的迫切要求，促进了政府和科技工作者开发农药残留快速检测方法，即使用现场快速检测方法对日益增长的大量样本进行初步筛选，然后再采用标准的方法进行测定。

近年来，随着人们对食品安全和环境质量的要求越来越高，生物测定技术以其简单、快速、灵敏、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶技术、酶联免疫技术、PCR技术、基因差异显示技术、生物传感器、基因探针、生物芯片等现代生物技术测定农药残留，已成为国内外科学工作者研究的热点。

但是目前的测定方法如酶抑制法、免疫分析法只能达到定性和半定量的水平，还无法取代常规气相色谱和高效液相色谱方法，快速检测方法还需要继续完善，使之标准化。

5.1酶抑制分析测定法

蔬菜中的农药残留问题近年来引起了政府的关注，同时也成为舆论焦点。

但是蔬菜是种特殊的农产品，其保鲜期很短，如果采用常规的检测方法，没等检测完毕，蔬菜就已经失去了食用价值，另外这类农产品农药残留问题较多、较严重，易引发急性中毒事件，因此用于检测蔬菜、水果等有机磷、氨基甲酸酯类农药残留酶抑制分析速测技术便应运而生。

5.1.1酶法概述

早在1951年，Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理，来测定其含量。

1975年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物，测定1～10µg的各种有机磷酸酯化合物，与此同时Zweig等也测定了甲萘威等农药。

1968年，Mendoza等利用薄层——酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药，最小检出量可达到ng水平，并作为一种经典方法被广泛采用。

进入80年代，人们开始以来源丰富、取材和制备都十分方便的植物酶源，建立薄层一植物酯酶抑制方法，为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件。

近年来，酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段。

美国堪萨斯一研究所（MidwestResearchInstitute,MRI）开发出一种称为农药检测器的“酶标签”（EngymeTichet），这种酶标签对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制灵敏，可用于测定水中有机磷和氨基甲酸酯农药，检测限在0.1～10mg/L。

其快速、简便，可以在田间或其他没有仪器的地方使用。

中国台湾农业试验所利用敏感的家蝇脑AChE建立生化法（即酶法）并研制出与此法相匹配的专用分光光度计，带有专用软件及打印机，用于测定蔬菜中的有机磷和氨基甲酸酯类农药，灵敏度为mg/kg级。

1987年，中国农业部环保科研所研制出农药残毒速测箱，其原理就是根据有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对动物和昆虫的毒理作用是通过特异性抑制胆碱酯酶来实现的，近年来华南农业大学、上海昆虫研究所、上海交通大学也先后研制出简易、快速检测有机磷农药的酶片和生色基质片，灵敏度在0.1～10mg/kg，适用于现场实测。

5.1.2酶法检测原理

有机磷和氨基甲酸酯类农药，都是神经毒剂，对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用，使该酶的分解作用不能正常进行，从而导致底物乙酰胆碱的积累，影响动物正常的神经传导，引起中毒或死亡。

研究工作者将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中，如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，试样中加入的基质就被酶水解，或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色很浅，用分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留情况。

AChE属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与AChE类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心，因此对AChE有抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药同样对羧酸酯酶有抑制作用，因此，依据其对AChE或羧酸酯酶作用的有无或大小，即可判断有机磷或氨基甲酸酯类农药的有无或含量多少。

基本检测原理可以简单概括如下：

样本加酶

酶活性被抑

酶活性正常

底物不被水解

底物被水解

加显色剂不显色

加显色剂显色

含有机磷或氨基甲酸酯类农药

不含有机磷或氨基甲酸酯类农药

近年来投向市场的产品，如酶片、酶标签、速测箱等大多是建立在上述显色反应基础上的，但是，除了有机磷和氨基甲酸酯类物质有可能对羧酸酯酶产生抑制作用外，某些氯代烟碱类似物对AChE也有一些抑制作用，因此检测过程中应该注意由此引起的假阳性现象。

5.1.3酶源选择与提取

酶源选择是生物酶技术应用的基础，其性质的好坏、特异性大小、稳定与否直接关系到检测的结果。

不同种类、不同来源的酶源，对检测灵敏度的影响如表5-1、表5-2所示。

表5-1比较了乙酰胆碱酯酶和非特异性酶在检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂残留时的特性，表5-2则给出了不同来源非特异性酶的特性比较。

表5-1　　非特异性酯酶和乙酰胆碱酯酶检测农药残留特性比较

特性项

非特异性酶

乙酰胆碱酯酶

检测特异性

酶的灵敏度

酶的来源

其它化合物的干扰

操作

低

中

广

多

简单

高

高

相对稍窄

少

简单

表5-2　常见杀虫剂对３种不同来源非特异性酯酶抑制的I50和I90（mol/L）

酶源　

α－乙酸萘酯

β－乙酸萘酯

I50值数量级

I90数量级

I50数量级

I90数量级

家蝇

植物

马血清

10－7～10－2

10－7～10－3

10－17～10－2

10－5～10－2

10－5～10－1

10－6～10－2

10－6～10－3

10－6～10－3

10－15～10－2

10－3～100

10－5～10－4

10－4～10－1

在酶抑制检测的技术中，既有应用AChE的，也有应用非特异性酯酶（如羧酸酯酶）的，其来源既有动物的，也有植物的，但应用动物酶源的居多，由于方法本身对酶纯度要求并不太高，因此，一般方法提取的酶液便可满足要求。

1.家蝇或蜜蜂头的脑酯酶液

　　采用3日龄敏感家蝇或蜜蜂在-20℃冷冻致死后装入塑料袋中，加入少许干冰振摇，硬化了家蝇或蜜蜂的头部与胸部断裂分开，收集头部，按0.24g/mL在磷酸缓冲液（pH＝7.5，0.1mol/L）中匀浆30s，匀浆液（4℃）以3500rpm离心5min，取上清液经双层纱布过滤，滤液经双层滤纸在布氏漏斗上抽滤，将滤液以每管1mL分装，密封于-20℃冰箱中备用。

应用时以pH＝7.5，0.02mol/L磷酸缓冲液稀释15倍。

该酶液保存3个月后未见酶活力下降。

为便于运输和贮存，提取纯化后可经冷冻干燥，制成纯度比较高、稳定性更好的酶粉。

2.动物肝酯酶液

取动物（牛、猪、兔、鼠、鸡）新鲜肝脏，去筋、膜、脂肪后切碎，取1份肝＋3份蒸馏水（W/V）匀浆，匀浆液以2000～3000rpm离心15～30min，上清液分装后在-20℃下储存备用，使用时以蒸馏水稀释，稀释倍数一般为5～20倍。

3.动物血清酯酶

将刚抽取的动物（马、鸡）血清注入无抗凝剂的试管（15～25mL）中，封口后在37℃恒温箱内放置3h。

使血液凝固，淡黄色血清慢慢渗出，用吸管将血清吸入离心管中以3000rpm离心5～10min，取上清液分装后在-20℃冷冻保存，使用时以蒸馏水稀释。

4.植物酯酶液

取市售面粉，按1∶5（W/W）比例加入蒸馏水，在振荡器上振荡30min，以3000rpm离心10min，上清液经滤纸过滤，滤液置冰箱（4℃）保存，使用时加蒸馏水稀释。

应该指出，植物酯酶和肝酯酶是应用较少的酶源，常用的是脑酯酶和血清酯酶。

5.1.4底物和显色剂

酶抑制剂显色反应可使用的底物（基质）和显色剂很多，如乙酰胆碱（ACh）、乙酸萘酯以及其它羧酸酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物均可作为酶的底物，根据酶的底物和显色机理不同，酶抑制显色反应，大致可分为以下几种类型。

1.乙酰胆碱－溴百里酚蓝显色

利用底物水解产物的酸碱性变化，并借pH指示剂显色。

乙酰胆碱＋H2O胆碱＋乙酸

溴百里酚蓝变色范围pH6.2（黄色）～7.6（蓝色），酶作用的底板部位为有乙酸的部位pH<6.2，呈现黄色，而被农药斑点作用的部位为无乙酸的部位，pH>7.6，呈现蓝色。

2.乙酸－β－萘酯—固蓝B盐显色反应法

　　利用底物水解产物与显色剂作用完成显色反应

乙酸-β-萘酯＋H2Oβ-萘酚＋乙酸

　　β-萘酯＋固蓝B盐→偶氮化合物（呈紫红色）

3.乙酸羟基吲哚显色法

利用底物水解产物氧化显色

乙酸羟基吲哚+H2O吲哚酚+乙酸

吲哚酚+O2→靛蓝（呈蓝色）

4.乙酸靛酯显色法

利用发色基质水解产物显色。

乙酸靛酯+H2O靛酚蓝（蓝色）+乙酸

实验表明，乙酰胆碱—溴百里酚蓝显色法灵敏度不高，故很少使用。

而乙酸萘酯—固蓝B盐、乙酸靛酯、吲哚乙酸酯及其衍生物为基质的羧酸酶显色法，由于灵敏度高，适用性广，酶源、基质、显色剂较容易获得，而被广泛应用。

另据报道，影响酯酶法显色的灵敏性的因素是多方面的，取决于酶源和基质的种类，以及两者适宜的配合。

不同的酶与基质的配合使用，其检测限不尽相同。

5.1.5检测方法

近年来，随着日益突出的农产品，尤其是蔬菜中农药残毒问题，国内外科技工作者利用酶抑制原理，开发研究农药残毒速测技术已成为热点，其目的主要是为了减少实验室内仪器分析的工作量，在短时间内，甚至可以在现场，对大批量样品进行快速筛选，对不合格样品再进行复检，对复检仍不合格的少量样品再用气相色谱或高效液相色谱法进行分析。

1.比色法

取样

提取

抑制反应

培养

显色反应

取2g样本（非叶菜类取4g）

切碎

加入20mL提取试剂，

振荡１～２min

将上清液倒入试管中，静置3～5min，于平底小试管中加入50μL酶、3mL样本提取液、50μL显色剂

在37℃－38℃下培养30min

于待测的5只平底小试管内

分别加入50μL底物

将反应物倒入比色杯内，按顺序放入仪器的比色槽内测定。

仪器测定

我国农业部农药检定所，利用酶抑制产生的显色反应，通过分光光度计比色测定酶的抑制率，以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量。

其检测流程如下：

蔬菜样品的制备通常取1g样品剪碎于试管中，加0.5mL～1mL甲醇，快速振摇2min，将提取液倒入比色皿，取20μL进行测定。

AChE抑制率的测定：

在5mL尖底离心管中加0.18mLpH7.5的0.02mol/L的磷酸缓冲液，对照管加0.02mL甲醇，测定管加0.02mL蔬菜样本提取液，然后分别加入0.2mL酶液；30℃水浴保温20min后，各加入0.1mL碘化乙酰硫代胆碱液AtchI（浓度为0.01mol/L），继续培养15min，最后加入终止剂3.6mL二硫双硝基苯甲酸DTNB-乙醇溶液，用分光光度计在412nm下测吸光度值。

空白管和对照管则以缓冲液代替酶液。

几种农药的最低检出浓度和回收率见表5-3和5-4

表5-3AChE抑制法测定几种农药的最低检出浓度

农药名称

AChE抑制率10%

AChE抑制率16%

最小检出量（μg）

最低检出浓度（mg/kg）

最小检出量（μg）

最低检出浓度（mg/kg）

敌敌畏

0.00016

0.0041

0.00027

0.