如何理解测序蜂图解读.docx
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如何理解测序蜂图解读
测序峰图
测序方法
现代DNA序列测序可分为一二三代。
一代测序
第一代测序技术包括链终止法和化学降解法,其主要特点是以待测DNA为模板,根据碱
基互补规则采用DNA聚合酶体外合成新链。
由于新链中渗入了带有标记的碱基类似物,可用于制备末端带有标记的DNA单链。
这些末端带有标记的DNA单链是一个群体,在凝胶电泳时可以形成彼此仅差一个碱基的梯形条带。
根据末端碱基的特有标记可以读取待测DNA的序列组成。
链终止法(Sanger法)
反应分别在4个试管中进行,每一试管中都含有:
1.待测的DNA单链片段,作为模板;
2.DNA聚合酶;
3.序列已知且与模板3'端互补的引物;
4.四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTPdCTP和dTTP);
5.四种双脱氧核苷酸中的一种,作为DNA链合成的末端终止剂。
在适当条件下进行互补链的合成,由于新掺入的核苷酸只能同新生链3端的-OH连接,而
2'3'-双脱氧核苷三磷酸核糖基的2'3位-OH的氧已脱掉,失去了和后来的核苷酸连接的可能性,这时碱基的掺入就有两种可能性:
1.dNTP掺入新生链,使链继续延伸。
2.2'3'-ddNTP掺入,使新生链的合成终止
由于两者掺入的几率不同,就形成一套长度不一的DNA片段。
最后通过A、T、G和C四
组反应的凝胶电泳放射自显影图谱,即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。
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要求测序时使用的DNA聚合酶不能有5'-3外切酶活性(可将新合成DNA链的5'末端除去核苷酸而改变链的长度)、3'-5'外切酶活性(可将错配的碱基除去,再补上正确配对的核苷酸)。
这两种活性会产生干扰条带。
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5Z
荧光染料标记物在Sanger法中的应用
目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物,可将其分别与指定的ddNTP结合,如ddATP
标记绿色荧光,ddCTP蓝色荧光,ddTTP红色荧光,ddGTP黑色荧光。
这四种标记的ddNTP混合加入到一个反应中,聚合链终止反应完成后,可以获得末端分别带有A、C、T和G的DNA单链。
毛细管电泳
带电粒子在电场力的驱动下,在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技术。
样品心电琳液中泳动,根抠物厉利荷/质比差异来进行分离,出值愈人,圖即康快
测序峰图
峰图是以4种颜色连续的峰型图代表A、T、G、C4种碱基序列的图。
峰的高低说明了信号的强弱,宽窄表示的是分离效果,可以对比板胶电泳的亮度和条带的宽窄。
重叠则说明了样品中有长度相同但是序列不同的片段。
读长:
序列读取的碱基长度,峰图上方横向显示的数字。
信号:
测序序列是通过对不同碱基所携带的不同颜色的荧光信号翻译所得,荧光信号的强弱是我们常说的信号。
成功峰图?
峰型:
尖锐、对称、无底峰;
读长:
800bp可信;
信号:
正常(1k〜20k),走势平缓下降。
测序峰图中可能存在的问题vi峰型问题
双峰夹峰
|非单克隆
杂合
|引物移码
结合问题
模板量高
宽峰
胶有气泡
模板不纯
底峰不干
净
模板不纯
信号弱
可信读长问题
起始序列不准
引物峰
引物二聚体峰
特定位置序列不准
信号问题
衰减或中断
弱或无
模板和引物结合较弱
模板和引物不结合
双峰非单克隆
特征:
从插入位点开始双峰或某个位置开始双峰
处理方法:
重新挑单克隆测序
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_TiC□i.TTCGiGCTCGGT;匚匸匸GGGCiTCCTCTAGAGiTT4TTTC£A□ai匚石叮匚iCGCiGCGCTTGCGGCTTGTGiCCiTCi
杂合(突变)
特征:
峰图中某些位置双峰
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H13口140150L60I7n】旳
CTGTTCAC匚AiiTTTTAGT丁GACTAALGZTG匚AGTGdTTGJi禹匚I■占TGGdTT&2TT更盘代
Figure1SNP
Figure2杂合
缺失
特征:
从碱基缺失位置出现移码。
移码
底峰序列表现为主峰向左或向右移动后的序列
44046Q4704S049QSOOSIQ顷EQ530
TTTG^GQkTTTTXATCTCTTTTCVCiTiTXTCTG卫厶A,TATATTGAI^ACAATTCiA.TATCGjlTAJUITCAJ1ATGTT7囲IGTATT7TTAJlTiTAGT止TV
引物问题(YM):
引物合成不纯或降解
特征:
序列一开始就出现移码现象处理方法:
重新合成引物再测序
胡?
000帅10011012013Q]
T*T5qcq*C*GCTTC4TCCGJlGTCT*A**TCACATTTiTCGATG^TCjlC*AAGCTATTTTiTTAC>CCGCGGTTACCCGATT
结合问题(JH)
特征:
(1)一开始就是双峰,在某一点终止或从头到尾双峰
可能原因:
模板上有2个或2个以上以上引物结合位点、模板或引物不纯处理方法:
重新制备样品或设计特异引物测序
夹峰:
模板量高
特征:
峰图中两峰之间夹有小杂峰,一般不影响主峰的读取,在信号图中表现为反应信号过高。
处理方法:
直接或稀释重跑,降低模板量测序
宽峰
可能原因:
模板不纯或P0P7胶中有气泡
处理方法:
重跑
底峰不干净
特征:
信号图中基线不齐或信号弱
可能原因:
模板纯度不好,有杂质;模板量偏低或反应进行不充分
处理办法:
重新纯化或重送样;加量重做或重送样
引物峰及引物二聚体峰
特征:
在20-30、40-60bp碱基处有高信号的峰形成,之后信号可能衰减。
处理方法:
重新合成引物或重新设计引物测序。
引物形成二聚体致使反应无信号
干扰峰(染料峰)和酒精峰
特征:
4个干扰峰固定出现在30、40、70、110bp附近
处理方法:
重新测序
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染料上黔佞于肓亍・OO题乞基忙人内,禺壬普窸导台岛,商#青峰伎于20。
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降解峰
特征:
在220、450bp附近G碱基降解,峰型扩散。
处理方法:
若不影响碱基判读不安排调整,否则安排重新测序
重复序列(CF)
特征:
单碱基或两个以上碱基重复出现,导致后续峰图可能移码或乱峰。
处理方法:
因重复未测到的序列,建议加测反向补拼。
I?
To5Tot日"
TACATAkGGi.CGTGGAGAAAGGh血血皿止弧血业血亠丁GTiCGTiTGTGT1TTGTGTATTTGTG
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LCAA1CCCGIGQGGIGGGG0>CCCGGWG■匚G0CGGTTQTGGGGTGTGGGGSCCGGGCTIT1
高GC(GC)
特征:
序列局部碱基GC富集,之后可能信号衰减,峰图变乱。
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TGCTGGTGC亡tS右t^C;亡1:
占亡T右亡TEG亡右C亡右QCGTTCGTdrtCTCGGGGGCGTTCGGCGCGG亡Cit
回文结构及其他结构(JG
特征:
信号衰减或中断,峰图变乱。
处理方法:
最好选用GC优化程序
无信号
特征:
峰图表现为杂乱无章形成原因:
弓I物和模板不能正常结合反应,包括漏加,加错,有影响结合或影响反应因素
处理方法:
菌液用通用引物测无信号的安排重新摇菌、自带引物无信号建议通用引物测序;质粒、per测序无信号的不调整,建议客户重新送样,若失败较多的挑几个重测,并跟客户说明情况
在进行DNA测序时,紧接引物的10〜30碱基有时不一定能完全读清楚
读书的好处
1、行万里路,读万卷书。
2、书山有路勤为径,学海无涯苦作舟。
3、读书破万卷,下笔如有神。
4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。
一一达尔文
5、少壮不努力,老大徒悲伤。
6、黑发不知勤学早,白首方悔读书迟。
一一颜真卿
7、宝剑锋从磨砺出,梅花香自苦寒来。
8、读书要三到:
心到、眼到、口到
9、玉不琢、不成器,人不学、不知义。
10、一日无书,百事荒废。
一一陈寿
11、书是人类进步的阶梯。
12、一日不读口生,一日不写手生。
13、我扑在书上,就像饥饿的人扑在面包上。
高尔基
14、书到用时方恨少、事非经过不知难。
一一陆游
15、读一本好书,就如同和一个高尚的人在交谈一一歌德
16、读一切好书,就是和许多高尚的人谈话。
笛卡儿
17、学习永远不晚。
一一高尔基
――刘向
18、少而好学,如日出之阳;壮而好学,如日中之光;志而好学,如炳烛之光。
19、学而不思则惘,思而不学则殆。
一一孔子
Molecularbiology5thedition.Weaver
ThemethodsofDNAsequencing,WestOneServices
《基因组学第三版》,杨金水
互动百科
v引自Molecularbiology5thedition,Weavervi此部分峰型图由华大基因(BGI)提供。
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