玉米种子室内检验学习心得.docx
- 文档编号:6119411
- 上传时间:2023-01-03
- 格式:DOCX
- 页数:11
- 大小:26.86KB
玉米种子室内检验学习心得.docx
《玉米种子室内检验学习心得.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《玉米种子室内检验学习心得.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
玉米种子室内检验学习心得
学习心得
1、扦样分样技术
1、袋装种子扦样频率
a1-4个容器,每个容器扦取3个初次样品;
b5-8个容器,每个容器扦取2个初次样品;
c9-15个容器,每个容器扦取1个初次样品;
d16-30个容器,种子批中扦取15个初次样品;
e31-59个容器,种子批中扦取20个初次样品;
f60或更多容器,种子批中扦取30个初次样品。
以前扦样有时没有严格按照这个标准来取,以后取样要严格按照标准执行。
2.制备送验样品
(1)需磨碎的种类100g,不需磨碎的为50g;
(2)真实性样品100g。
3.机械分样法
混合2-3次,对分递减分至所需重量,每类样品要独立分取。
4.如果发现种子异常,要进行异质性检测判定。
2、抓关键技术环节,控制影响因素
1.检验员(人)
(1)熟悉有关的法律、法规规定
对种子法还不熟悉,种子检验理论和技术还有待加强和提高。
(2)具有良好的职业道德
爱岗敬业,诚实守信,客观公正,遵纪守法等。
2.种子生活力和种子活力
种子生活力:
种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。
反映的是种子发芽率和休眠种子百分率的总合。
种子活力是指在广泛的环境条件下,决定可接受发芽率的种子批的活性和性能那些特性的综合表现。
与种子田间出苗质量密切相关。
3.发芽结果计算与表示
当重复正常幼苗百分率都在容许差距范围内,则取其平均数;当重复间超过容许差距时,要重新试验。
4.发芽试验数据修约
a)先将正常幼苗百分率修约至最接近的整数,0.5进位,并与其余部分(不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子)百分率整数部分的数值相加。
如果总和为100,则修约程序结束。
b)执行a)程序后的总和不是100,则在不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子百分率中找出小数部分最大数值者,将此修约至整数,并作为最终结果。
并与其余部分百分率整数部分的数值相加。
如果其总和为100,则修约程序结束。
c)执行b)程序后的总和不是100,继续重复执行b)程序,直至获得总和为100。
d)执行b)和c)程序时,凡小数部分均相同的,按照下列顺序优先进行修约:
不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子。
5.发芽试验重复间和重复试验间超差的处理:
(1)假如四次重复间最高和最低值的差距在容许误差范围内,该发芽试验的结果是可靠的。
将各重复的平均数修约成最接近的整数,查容许误差表,如重复间的最大差异小于规定的容许误差,则认为结果是可信的。
容许误差至少适用于正常幼苗种类。
(2)当重复间的差距超过表中最大容许误差时,应采用同样的方法重新试验。
如果第二次结果与第一次结果相符合,即其差异不超过表中规定的容许误差,则填报两次试验的平均数。
(3)如果第二次结果与第一次结果不相符,即其差异超过表中所示容许误差,则采用同法第三次试验,如果三次试验的结果相符合,即其差异不超规定容许误差,则填报三次试验结果的平均数。
如果三次试验结果不相符,即其差异超过规定容许误差,则三次试验结果进行两两比较,取不超过容许误差的一对结果的平均值作为最后结果。
若第三次试验仍得不到符合要求的结果,则应考虑人员操作、仪器设备或其他反面原因。
三、实验室质量管理
1、质量法规
对《产品质量法》、《标准化法》、《种子法》、《农作物种子标签和使用说明管理办法》等的学习有待进一步学习。
2、质量与检验
(1)从过程管理的角度来看,质量绝对不是检验出来的,预防产生质量,检验不能产生质量;
(2)合格产品不是检验出来的,而是干出来的;
(3)检验可以发现不合格产品。
3、种子检验室质量管理
应建立相适应的有效的管理体系,形成文件,将抽样到结果报告各环节检验活动标准化、制度化。
管理体系文件一般包括四个层次:
《质量手册》、《程序文件》、《作业指导书》、《记录格式》。
4、试验要求
(1)若发现试验结果异常,试验人员不要轻易下结论,应认真查记录、查计算、查操作、查试剂、查方法、查样品,找出原因后有针对性地进行复验。
(2)要认真及时做好原始记录,要求所有的实验内容都要有原始记录,不得漏记。
5、记录控制要求
(1)试验数据应用中性笔或钢笔在实验同时记录在原始记载表上,不应事后抄录,也不应漏记。
试验中出现的异常情况也应及时记录。
书写要求工整、清楚、真实、准确、完整。
不准用铅笔记录,不得随意涂改、乱写、乱画和折叠。
当发生笔误时,用“-”注销,并在“-”上方由本人更正,加盖改正章。
(2)试验原始记录要按年编目成册,做好标识,归档保管。
(每年做一次整理归档)。
6、检测数据修约规则
(1)称重规定:
1g以下保留四位小数,1~10g保留三位小数,10~100g保留二位小数,100~1000g保留一位小数。
(2)在净度分析中,各成分之和是99.9%或100.1%,从最大值(通常是净种子成分)增减0.1%。
(3)数字修约规则:
“四舍六入五成双”法则。
(4)检测室报出数值最右的非零数字为5时,应在数值后面加“(+)”或“(-)”或不加符号,以分别表明已进行过舍进或未舍未进。
四、净度分析水分测定
1、净种子
未成熟的、瘦小的、皱缩的、带病的或发过芽的种子单位都应作为净种子。
2、试验样品的分取
试验样品至少含有2500个种子单位的重量,玉米种子不少于900克。
3、净度分析称重计算
(1)如果增失超过原试样重量的5%,必须重做。
(2)如增失小于原试样重量的5%,则计算各组分百分率。
各组分百分率的计算应以分析后各种组分的重量之和为分母,而不用试样原来的重量。
(3)若分析的是全试样,各组分重量百分率应计算到一位小数。
若分析的是半试样,各组分重量百分率应计算到二位小数。
4、净度分析容许差距
实际差距容许范围内,取其平均值。
如超过,再分析一份试样,若分析后的最高值和最低值差异没有大于容许误差2倍时,填报三者的平均值。
4、净度分析容许差距
若一种组分的结果为零,须在适当空格内用“-0.0-”表
示,若其一组分少于0.05%,则填报“微量”。
五、玉米品种鉴定技术-SSR标记法
1、SSR技术特点
•多态性丰富,分辨能力强,每个位点最多可含有十多个等位基因;
•较高重复性,针对于每个位点设计特异性引物,扩增均为特异性目的片段扩增;
•前期研发基础强,有大量已知染色体位置的共享位点;
•为共显性标记,能准确区分不同等位变异;
•为中性变异标记;
•数据形式为具体片段长度,能够实现数据标准化;
•技术非常成熟,检测方法简便易行;
•SSR技术易于推广,不受专利限制。
2、DNA提取的原则
(1)保证DNA结构的完整性;
(2)将蛋白质、多糖、多酚等杂质降低到最低程度;
(3)排除有机溶剂和金属离子的污染;
(4)纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质;
(5)排除其他核酸分子的污染。
3、快速碱煮法
(1)碱:
在碱性环境下裂解细胞,使DNA变性,从而达到提取的目的。
碱能够使DNA变性,且不会复性,并缠结成网状物质析出最终加入TE溶液溶解。
(2)煮:
煮沸的方式能够代替液氮冷冻法,抑制DNA酶的活性,防止煮沸还能够代替研磨,破坏细胞壁和细胞膜,释放出DNA。
4、核酸提取注意事项
•最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融
•材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低
5、DNA提取量少
(1)主要原因
实验材料不佳或量少;破壁或裂解不充分;沉淀不完全;洗涤时DNA丢失
(2)解决方法
尽量选用新鲜(幼嫩)的组织;样品预处理充分;适当延长高温裂解时间;用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒;低温沉淀,延长沉淀时间,加沉淀辅助物
6、PCR扩增
(1)PCR,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
(2)一是被扩增的DNA所需量极小,理论上讲一个分子就可以用于扩增了;二是扩增效率高,几个小时就扩增1000万倍以上。
7、PCR反应体系及循环条件
PCR反应是Taq酶以dNTP为原料,以一对寡核苷酸引物为起点,以被扩增的DNA序列为模板在PCR热循环仪中进行的扩增反应。
标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性(90℃-96℃):
双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
2.退火(25℃-65℃):
系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸(70℃-75℃):
在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。
8、模板DNA对PCR反应的影响
(1)模板纯度:
蛋白、酚类、多糖等杂质会抑制PCR反应;
(2)模板完整性:
模板DNA降解会导致PCR无扩增产物;
(3)模板浓度:
实验表明:
在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。
模板的量与循环数要匹配,如果循环数一定,模板的量太少,会出现阴性结果或条带很弱;模板的量太多,则会出现条带弥散,模糊不清。
(4)PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
(5)PCR反应体系中引物的浓度一般为0.1~0.5umol/L,在此范围内,PCR的产物量基本相同。
(6)若引物量过低会导致PCR产物量降低,而如果引物量过高,则会引起碱基的错配和非特异性扩增、生成引物二聚体,从而使目的DNA片断的扩增量下降。
(7)通常引物量应当10倍于靶序列。
此外,引物的Tm值与退火温度相关,故引物的Tm值最好在55~80℃的范围。
(8)高浓度dNTP易产生错误掺入,过高则可能不扩增;但浓度过低,将降低反应产物的产量。
(9)PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。
四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同,如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低),就会诱发聚合酶的错误掺入作用,降低合成速度,过早终止延伸反应。
(10)此外,dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
因此,dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
(11)耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子。
(12)反应体系中Mg2+浓度过低,会显著降低酶的活性;而Mg2+浓度过高时,又使酶催化非特异性扩增增强。
(13)Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度,从而影响扩增片度的产率。
(14)由于在PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低反应体系中的Mg2+的浓度,而耐热DNA聚合酶需要的是游离的Mg2+,因此,一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。
(15)在不同的反应体系中模板DNA、引物以及dNTP的量各不相同,因此应根据具体的情况来确定特定PCR反应体系中Mg2+的最适浓度。
9、PCR循环条件
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟。
使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。
10、无扩增产物
(1)原因
模板含有抑制物,模板含量低;该Buffer对样品不合适;引物设计不当或者引物发生降解;反应条件不适,退火温度太高,延伸时间太短。
(2)对策
纯化模板;更换Buffer或者调整浓度;重新设.引物;降低退火温度,延长延伸时间。
11、PAGE电泳检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamidegelelectrophoresis),是由丙烯酰胺(简称Acr)单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)通过化学催化剂AP(过硫酸铵)和加速剂TEMED(四甲基乙二胺)形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离,且分离效果好。
12、注意事项
(1)在配制胶时,过硫酸铵最好现配现用,不要先配AP(过硫酸铵)溶液,因为AP很容易变质。
而且过硫酸铵固体时间过久也会失效的。
(2)电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。
建议经常更换电泳缓冲液。
(3)丙烯酰胺为神经剧毒和可疑致癌物,实验过程中应穿工作衣,戴手套并加倍小心。
13、SSR技术在品种真实性鉴定中的应用
(1)成对比较
a)与来自农业部品种权保护的标准样品比较;
b)与已审定品种标准样品比较;
c)与模仿对象进行比较。
(2)数据库比较
a)在品种权保护中,辅助筛查申请品种的最近似品种,代替原来由申请者自行提供。
b)在国家和各省区试中,鉴定区试品种是否与已知品种雷同,并作为品种能否推荐审定的必要条件。
c)在种子市场打假中,鉴定市场抽检的品种仿冒了什么已知品种。
14、纯度鉴定流程
(1)引物筛选
利用至少10个核心引物进行筛选和评估(杂交种取20粒),一方面确定该纯度问题是以自交苗、回交苗、其它类型杂株还是遗传不稳定造成的,一方面挑选出合适的双亲互补型引物进行下一步鉴定。
(2)样品鉴定
从待测样品中随机取样至少100粒种子,利用确定下的若干引物进行进一步鉴定,并利用这些引物综合判定待测杂交种的纯度。
如果是自交苗造成的,采用其中1个互补型引物即可;
如果是回交苗造成的,则应采用2-4个能够综合判定出回交苗的互补型引物;
如果是其它杂株,则根据实际情况选择1-2个能够将杂株鉴定出来的互补型引物;
如果是遗传不稳定,则尽量剔除一致性极差的位点,对一致性表现较相近的引物中选择1-2个进行鉴定。
(3)结果表示
根据所选引物对各单株的检测结果,综合判定待测杂交种的纯度,如果提供了父母本的话,原始记录中需要区分自交苗(NM)和其它类型杂株(NQ,含回交苗、异品种等造成的杂株);如果没有提供父母本的话,原始记录中只需提供杂株(即自交苗也是杂株的一种)。
品种纯度检测结果按以下公式计算:
P(%)=
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 玉米种子 室内 检验 学习心得
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)