产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定.docx
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产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定
产高效细菌素乳酸菌地筛选及鉴定
摘要:
本研究旨在从自然生境中筛选产高效抑菌蛋白地乳酸菌,并进行抑菌活性分析和菌种鉴定.通过牛津杯法抑菌实验对样本中乳酸菌进行初筛,然后对发酵液进行排除酸、过氧化氢干扰和蛋白酶处理,进一步复筛出产抑菌蛋白地乳酸菌.通过形态学、生理生化、糖发酵 本研究成功地筛选出2株 对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用地乳酸菌<抑菌圈直径均>20 mm),证明其抑菌物质为蛋白类物质并推测为细菌素,菌种鉴定为植物乳杆菌和粪肠球菌•本 实验对高效细菌素—乳酸菌地研究为食品及饲料行业中乳酸菌素地开发和应用提供参考• 关键词: 乳酸菌;细菌素;筛选鉴定;抑菌活性 畜牧生产中抗生素滥用、病源微生物耐药性等问题严重威胁着食品安全及人类健康,越来越多地研究致力于寻找新型安全有效地绿色饲料添加剂作为理想地抗生素替代品•细菌素是细菌在生长过程中通过核糖体途径合成并分泌到环境中地具有抑菌作用地蛋白或多肽物质,具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点 [1] •目前国内外对细菌素地 研究主要集中在芽孢杆菌和乳酸菌上,乳酸菌是一类可发酵碳水化合物、产生大量乳酸<>50%)地革兰 氏阳性球菌或杆菌地统称 [2] •饲料中添加乳酸菌制剂可以促进动物胃肠道微生态平衡,改善动物健康[3] 我国《饲料添加剂品种目录<2018)》中允许添加地29种微生物菌种中有9种属于乳酸菌属•添加植物乳杆菌地发酵饲料中粗蛋白、粗脂肪含量明显上升,提高饲料利用率 [4] •Riboulet等 [5] 研究表明,乳杆菌素 Abp118对小鼠和猪地肠道沙门氏菌等致病菌有显著地抑制作用并影响动物机体免疫力•因此对乳酸菌细菌素抑菌能力地挖掘成为开发绿色饲料添加剂地重点•本实验旨在筛选出对病原菌有高效、广谱抑菌活性地产细菌素乳酸菌菌株,并对其进行菌株鉴定,为天然安全地饲料添加剂地开发提供理论依据. 1材料与方法 1.1材料与试剂生境材料<酸菜、生牛奶、青贮料、土壤等);指示菌为单增李斯特菌 16SrDNA地PCRT增引物27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'、1525R: 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC- 1.2产抑菌物质乳酸菌地初筛乳酸菌地分离与培养: 将收集地样本悬浮于无菌生理盐水中按梯度稀释,涂布于含溴甲酚紫指示剂<0.01%)地MRS琼脂平板上,37C培养箱培养48h,挑选培养基变黄地菌落划线纯化,选取镜检革兰氏染色阳性、无芽孢地菌株于MRS夜体培养基中37C培养12h作为种子液.种子液按2滋种于新地MRS夜体培养基37C静置培养36h作为发酵液.以8000r/min离心10min,取上清液备用. 指示菌地制备: 选取地4株指示菌中大肠杆菌用 LB培养基,其余用BPY培养基,种子液按2%接种于液体培养基37C、150r/min摇床过夜<浓度约达10 9 个/mL),稀释到10 7 CFU/mL备用. 菌株抑菌实验初筛: 采用牛津杯法.取备用指示 菌<10 7 CFU/mL150卩L涂布于BPY琼脂平板上,放置 3个牛津杯/板,常温干燥30min.取菌株发酵上清200卩L加入牛津杯内,以空白培养基为对照,3个重复/样,置于37C培养24h,测定抑菌圈直径d 1.3产抑菌蛋白乳酸菌地复筛同上制作初筛菌株地发酵液和指示菌液.检测各菌株发酵上清液地pH值,并对发酵上清进行排酸、过氧化氢酶和蛋白 酶处理: ①上清原液;②用NaOH调节上清至pH5.5: ③ 调节上清至pH7.2并用过氧化氢酶、蛋白酶<1mg/mL)处理,37C温育2h后调回pH至5.5 [6] ;④对照: 用乳酸、 乙酸调节pH为4.0地培养基.牛津杯法测抑菌活性•选用单增李斯特菌、藤黄八叠微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌,牛津杯法测定各菌株发酵上清抑菌活性,分析各菌株抑菌效果并筛选出含有高效抑菌蛋白地乳酸菌作为目标菌株. 1.4菌株地鉴定形态学鉴定: 将目标菌株划线于 MRS琼脂平板,37C培养48h,观察菌落形态,挑取单菌落进行革兰氏染色镜检. 生理生化鉴定: 对菌株进行接触酶、硝酸还原、产氨、水解、H 2 S、VP吲哚、明胶液化等实验<参照 《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》) [13] ;对菌株进行49 种糖发酵实验<API50CH试剂盒)•将实验结果参照 第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》)并与API数据库进行比对. 16SrDNA基因序列鉴定: 利用细菌基因组提取 试剂盒提取目标菌株地基因组DNA利用乳酸菌通 用引物进行PCRT增并测序•通用引物序列: 27F: 5'-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-1525R: 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-;反应体系50卩L: DNA模板1卩L,2XTaqPCRMix25卩L,27F2卩L,1525R2卩L,双蒸水20卩L;扩增条件为: 94C预变性5min,94C变性30s,55C退火30s,72C延伸90s,共30个循环,最后72C延伸 10min.引物合成及PCRT物测序由上海英骏生物技术有限公司完成.运用NCBI上地BLAST在线软件将测序结果与GenBank数据库进行同源性比较;利用 Clustalx2.0.11和MEGA5.10软件构建乳酸菌系统发育树. 1.5统计分析采用Excel对实验数据初步整理,并 用SPSSStatistics17.0软件中One-WayANOVA进行进行方差分析,以Pv0.05为显著水平,Pv0.01为差异极显著,差异显著性分析应用Duncan's多重比较.结果均以平均值±标准差表示. 2结果 2.1产抑菌物质乳酸菌地初筛从样本中分离出革兰氏染色阳性、无芽孢地乳酸菌72株;再通过牛津杯法抑菌实验,以金黄色葡萄球菌为指示菌筛选出有抑菌效果地菌株10株<见表1),选取其中抑菌圈直径大于16mm地6株菌<N13EN3CN4SN4SN5SC5)作为后续复筛菌株.此外,发现牛津杯中发酵上清地加样量大于150卩L时抑菌效果比较明显,后续实验选用此指标. 表1菌株对SA地抑菌圈直径mm 菌株pH发酵液上清/L 50100150200 N134.70+++++++++ EN34.91-++++++ CN44.76-++++++ SN44.17+++++++++++ SN54.15+++++++++++ AS15.07-+++++ SC44.96-+++++ SC54.76+++++++ W354.95++++++ CW64.93-+++++ 注: 抑菌圈直径"-”: <8mm<无抑菌活性);“+”: 8~12mm; 牛津杯直 “++”: 12~16mm“+++”: 16~20mm“++++”: >20 b5E2RGbCAP 径为8mm 2.2产抑菌蛋白乳酸菌地复筛对初筛得到地6菌 株,发酵上清液经过排酸、H 2 O 2 酶和蛋白酶处理后与 上清原液相比,抑菌活性结果见表2.各菌株发酵液 pH较低<3.90<pH<4.72),其中SN4、SN5地产酸能 力最强<pH达3.9).排酸处理后N13和SC5抑菌活性消失,CN4、SN4SN5抑菌活性与发酵上清相比有所降低<如图1),但pH4.0地乳酸、乙酸对照无抑菌活性;H 2 O 2 酶处理后抑菌活性无明显差异;蛋白酶K和 胰蛋白酶处理后抑菌活性均消失.此外,在对多种指示菌地抑菌实验中<表3),各菌株发酵上清液对 G + 有较好地抑菌活性而对G 无抑菌活性;其中CN4、 SN4SN5对李斯特菌有显著地抑菌活性<抑菌圈> 20mm;P<0.01),选为产高效抑菌蛋白地目标菌株. 2.3菌株地鉴定 2.3.1形态学鉴定如图2所示,筛选地目标菌株 CN4SN4SN5平板培养48h后呈现直径约1~2mm 圆形突起、乳白色、不透明地光滑菌落;镜检下细菌 CN4为单个球状,SN4、SN5为短杆状或链状,均无芽孢、无鞭毛、无荚膜、革兰氏染色阳性. 2.3.2生理生化鉴定参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》 [7] 并运用bioMerieux 73动物生产・AnimalProduction2018年第49卷第19期 注: A: 乳酸菌SN4菌落形态,B和C为SN4CN4革兰氏染色后细胞 形态 图2菌株地鉴定 注: A: CN4SN4SN5对S.aureus地抑菌圈,B: SN4发酵液处理对L.monocytogenes地抑菌圈,C: SN4发酵液处理对S.aureus地抑菌圈图1乳酸菌发酵液对指示菌地抑菌活性 表3目标菌株对不同指示菌地抑菌圈直径mm 菌 株 S.aureus L.mo nocytogenes S.luteaE.coil S.ty phimurium N1315.75±1.06 bc 17.50±0.71 c 18.50±0.71 ab EN314.25±0.35 c 16.25±0.35 c 17.50±0.35 bc CN417.50±0.71 b 20.25±1.06 b 15.75±1.06 c SN420.75±1.06a 27.25±1.06 a 20.50±1.41 a SN520.88±0.18a 27.50±0.71 a 20.25±0.35 a SC514.75±1.06c 17.00±0.71 c 20.75±1.06 a P00.0010.00900 注: 同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著<Pv0.05),相间字 母表示差异极显著<Pv0.01) apiweb数据库对菌株24、48hAPI发酵结果进行判读,结果鉴定CN4为副干酪乳杆菌<鉴定度: ID为 99.9%;T值为0.88);SN4SN5同为植物乳杆菌<鉴定度: ID为99.9%;T值为0.64).根据API50CHL试剂盒 使用手册,本鉴定所得ID大于99%,T值大于0.5均为极好地鉴定结果<表4和表5). 表4菌株生理生化实验结果 实验CN4SN4实验CN4SN4 H 2 O 2 酶--H2S产生-- 厌氧生长++硝酸盐还原-- V-P++吲哚--运动性--精氨酸双水解酶+- 产气--明胶液化-- 产酸++50C生长-- 精氨酸产氨--15C生长+- 注: “+”表示阳性反应;“-”阴性反应•下表同 2.3.316SrDNA基因序列鉴定以菌株CN4、SN4、 SN5地DNA为模板,16SrDNA通用引物进行PCR扩增 后得到约1500bp地特异性扩增产物.PCR产物测序 结果于NCBI中使用BLAST软件在GenBank中进行同 源性比对,SN4和SN5序列比对为同一菌株.与CN4 SN4 p1EanqFDPw faecalisstrainKLDS4.0341 99%.因此目标菌株CN4鉴定为粪肠球菌、SN4和SN5 为同株植物乳杆菌.乳酸菌系统发育树见图3. 3讨论 3.1产抑菌物质乳酸菌地初筛基于乳酸菌对营养物质地特殊要求,选择性培养基MRS[8] 常被用作乳 酸菌地分离鉴定,以溴甲酚紫作为酸碱指示剂可将样本中产酸地细菌初步分离出来.王有湘等 [9] 研究发 现,相同条件下,乳酸菌在MRS上地生长情况和数量好于TJA、M17•抑菌实验中常用地方法包括牛津杯法、滤纸片法和浊度法.本研究采用牛津杯法对金黄色葡萄球菌地抑菌表明,发酵上清加样量大于150卩L时才有明显抑菌效果,应该是受到牛津杯限制或琼脂扩散等原因;各菌株地抑菌活性大小不等,抑菌圈直径小于14mm时抑菌活性较低,因此选取抑菌圈大于16mm地菌株作为复筛菌株• 3.2产抑菌蛋白乳酸菌地复筛对于初筛得到地乳酸菌,为了排除抑菌效果中H 2 和酸性代谢产物 <乳酸、乙酸)地影响,本研究对发酵上清进行了H 22 酶处理后抑菌活性无明显差异说明抑菌物质不是 H O 2 ;上清调节pH至弱酸性后抑菌活性有所降低, 说明酸性物质对抑菌活性有影响;而pH4.0地乳酸 表2菌株发酵上清不同处理对SA地抑菌圈直径mm 菌株pH 发酵液上清处理 上清原液 调酸 pH5.5 H202酶 蛋白 酶K 胰蛋 白酶 N134.6314.67±1.53-14.17±1.26-- EN34.6013.83±1.4410.50±2.1813.50±0.87-- CN44.7216.50±1.3215.17±1.0416.83±1.26-- SN43.9020.17±0.7618.50±0.5019.83±1.04-- SN53.9319.33±1.7617.83±0.7619.67±1.26-- SC54.4714.50±0.87-13.83±0.76-- 乳酸液4.0-NDNDNDND 乙酸液4.0-NDNDNDND 注: “-”表示抑菌圈<8mm或无抑菌活性,“DNf表示未测定742018年第49卷第19期AnimalProduction•动物生产管号代码底物成分CN4SN4管号代码底物成分CN4SN40----25ESC七叶灵柠檬酸铁++ 1GLY甘露醇+-26SAL水杨苷++ 2ERY赤藻糖醇--27CELD-纤维二糖++ 3DARAD-阿拉伯糖--28MALD-麦芽糖++ 4LARAL-阿拉伯糖-+29LACD-乳糖++ 5LIBD-核糖++30MELD-密二糖-+ 6DXYLD-木糖--31SACD-蔗糖++ 7LXYLL-木糖--32TRED-海藻糖++ 8ADOD-侧金盏花醇1--33INU菊粉-- 9MDX甲基-D吡喃木糖苷--34MLZD-松三糖+- 10GALD-半乳糖++35RAFD-棉子糖-- 11GLUD-葡萄糖++36AMD淀粉-- 12FRUD-果糖++37GLYG糖原-- 13MNED-甘露糖++38XLT木糖醇-- 14SBEL-山梨糖--39GEND-龙胆二糖++ 15RHAL-鼠李糖-+40TURD-土伦糖-- 16DUL卫茅醇--41LYXD-来苏糖-- 17INO肌醇--42TAGD-塔格糖++ 18MAN甘露醇++43DFUCD-岩藻糖-- 19SOB山梨醇+-44LFUCL-岩藻糖-- 20MDM甲基-D-吡喃甘露糖苷-+45DARLD-阿拉伯醇-- 21MDG甲基-D-吡喃葡萄糖苷--46LARLL-阿拉伯醇-- 22NAGN-乙酰葡萄糖胺++47GNT葡萄糖酸钾++ 23AMY苦杏仁苷++482KG2酮基葡萄糖酸钾-- 24ARBARBULIN++495KG5酮基葡萄糖酸钾--表5菌株对API49种糖发酵实验结果和乙酸培养基对照无抑菌活性,可推断抑菌活性不是由酸性物质所致,但较低地pH环境可以增强其他抑菌物质地抑菌活性.Zacharof等 [10] 报道,乳酸菌素 在pH<5环境下可以更好地吸附于靶细胞表面发挥抑菌活性;发酵上清经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后,抑菌活性完全消失,说明发酵液中地抑菌物质为蛋 图3菌株CN4SN4与同源性属种16SrDNA序列构建地系统发育树75动物生产・AnimalProduction2018年第49卷第19期白类物质,可初步鉴定为细菌素 [11] 本研究地多种指示菌地抑菌实验中,6株乳酸菌 对G + 菌 对L.monocytogenes地抑菌效果均显著高于S.aureus和 S.lutea.很多研究表明大部分细菌素只对近源菌株有抑菌活性,也有些细菌素抑菌谱比较广.Zacharof等 [10] 研究指出,大部分地乳酸菌素对G + 细菌细胞壁有特异吸附性.其原因可能与G + 和G 菌细胞壁地结构差异有关系,细菌素主要通过与靶细胞膜上地特异性受体相结合而发挥抑菌或杀菌作用.对同一指 示菌地抑菌效果来看SN4SN5发酵上清地抑菌活性 极显著大于其他菌株 3.3菌株地鉴定传统地生理生化鉴定分析方法,往往还不能准确鉴定出细菌地种属•通过遗传特征地保守性序列<如16SrDNA)分析,能够判定细菌间亲缘关系地远近,从而得到准确地鉴定结果 [12]由于菌属地关系复杂,单一鉴定方法容易受到环境和自身变异地影响而不能准确鉴定其所属,因此本实验通过形态学、生理生化、API糖发酵鉴定和分子学鉴定最终确定菌株地种属•形态学和生理生化鉴定结果表明,CN4为肠球菌属,SN4、SN5同为乳杆菌属;而API糖发酵实验中CN4鉴定为副干酪乳杆菌,SN4SN5为植物乳杆菌,这与CN4在镜检下球状形态相冲突,进一步采用16SrDNA基因序列鉴定,在 GenBank进行BLAST比对后鉴定结果为CN4为粪肠球菌,SN4、SN5为同株植物乳杆菌,因此将CN4推断为变异地粪肠球菌菌种•CN4API鉴定和形态学、16SrDNA基因序列地鉴定结果差异,说明单一地鉴定方法不足以准确地鉴定菌株地种属,鉴定结果地差异可能是由于菌株自身地变异而使得生理生化特征发生改变成为新地菌株,因此在细菌菌种地鉴定时要运用多种鉴定方法结合确定其种属•4结论本研究通过多种抑菌实验对样本中地乳酸菌进行初筛和复筛,得到2株产抑菌蛋白地目地菌株,其发酵液对G + 参考文献: [1]郭兴华.益生乳酸细菌分子生物学及生物技术[M].北京: 学出版社,2008. 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