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044RNA干扰
RNA干涉
近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi,也译作RNA干预或者干涉)。
它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。
由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具,可以毫不夸张的说,RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐。
为此被Science评为2001年最重要的的成果之一。
RNA干涉的作用机理
在植物中,基因沉默发生于转录和转录后两种水平,而动物中迄今仅报道了转录后水平的RNAi。
目前认为RNAi至少包括两步RNA降解过程。
第一步,dsRNA降解形成特征性的与靶基因同源的22个核苷酸的RNA;
第二步,这些短核苷酸序列参与形成多亚基复合物,并引导复合物中的核酶降解特异性的信使RNA。
RNA干涉的作用特点
1.特异性抑制目的基因。
针对某些特定的内源基因的dsRNA转入动物体内或胚胎内,能特异性抑制该基因的功能。
而单链正义或反义RNA的抑制作用较弱或缺失。
2.广泛分布且可遗传。
DsRNA分子能够在线虫体内被有效转运至全身各处,用经小肠微注射或浸润喂食线虫的方法都能得到各组织中对靶基因的抑制,在体细胞和生殖细胞中能检测到RNA的表达,并且其子代也产生了对相应继因强烈而特异的抑制效应。
但这种遗传只限于子一代,子二代往往又回复到野生型。
3.靶序列的选择性。
RNAi的靶序列需要慎重选择,实验证明,外显子序列的
dsRNA能产生特异和高效的基因抑制作用,而只针对内含子序列的dsRNA不能产生这种作用。
dsRNA的长度对RNAi的效率有影响,但最短的有效长度目前还不清楚,一般认为应大于500bp。
选择靶序列时应避免高度同源序列之间的交叉干扰。
例如对线虫的体壁肌球蛋白重链的编码区基因进行RNAi实验,当选择其5’端高度保守区作为靶序列进行dsRNA注射时产生致死表型,而选择其他部分进行实验则产生预期的瘫痪表型。
RNA干涉的导入方式
1.电转化。
简单生物常用电转化方式导入dsRNA.
2.微注射。
多细胞真核生物的生殖细胞或早期胚胎,可采用微注射的方式
3.喂食表达dsRNA的细菌或浸浴到含dsRNA的溶液中。
线虫
RNA干涉的应用
RNAi的回顾
前言
转录后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS),原来曾经一度被认为是矮牵牛和少数几种植物的特殊现象,如今已成为分子生物学领域最热门的研究课题之一了
(1)。
在过去的几年中,研究表明这种现象在植物和动物中都会发生,并且参与抵抗病毒感染、转座子沉默机制(transposonsilencingmechanisms)等过程。
其中最引人注意的,就是RNA干扰(RNAinterference,RNAi,也有译作RNA干预或者干涉)——引入双链RNA(dsRNA), 通过特异性结合互补链从而抑制基因的表达,或者说是通过双链RNA引发转录后沉默,从而作为一种抑制细胞中某个基因表达的有力工具。
(reviewedin1-3).
RNAi是如何被发现的?
以怎样一种机制工作?
更重要的是如何利用这项强大的技术进行功能基因组的研究?
本文将概要的介绍并将提供大家一些相关的资料。
20多年前,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:
RichJorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。
Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制“cosuppression”,因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。
(1-5).
开始这被认为是矮牵牛的特有的怪现象,后来发现在其他许多植物中,甚至在真菌中也有类似的现象,特别是在脉孢霉Neurospora中进行了详细的研究(在这里被称为“quelling”)(1-3)。
然而是什么原因导致这种基因沉默的现象呢?
尽管对于部分植物来说,转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致,这被称为转录阶段基因沉默(transcriptionalgenesilencing,orTGS),但是,确实有部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的,称为post-transcriptionalgenesilencing,orPTGS)。
实验(Nuclearrun-onexperiments)表明同源转录本确实有出现,但是很快在胞浆中被降解,没有积聚(1,3,6)。
转基因会引发PTGS,然而silencing也可能被一些病毒诱发(2,3)。
一旦被引发,PTGS由一种可扩散的反式作用分子介导。
这首先在脉孢霉Neurospora中得到证实:
Cogoni和他的同事发现基因沉默可以在异核体的细胞核之间传递(1,7)。
后来Palauqui和同事进一步证实,在植物中,将出现转基因导致基因沉默的植物嫁接到另一没有基因沉默的植物中,同样可以导致PTGS。
在后来线虫和果蝇的实验中我们知道导致植物中的PTGS的反式作用因子是双链RNA(1-3)
RNAi是在线虫中发现的
首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditiselegans的研究。
7年前(1995)康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA作为对照,也同样阻断了基因的表达(9)。
这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次将dsRNA——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因Silencing。
实际上每个细胞只要很少几个分子的dsRNA已经足够完全阻断同源基因的表达。
后来的实验表明在线虫消化道中注入双链RNA不但可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。
他们将这种现象称为RNA干扰(RNAinterference,简称RNAi,10)
RNAi潜在的作用促使Fire和Timmons继续实验,将能够表达与C.elegansunc-22基因同源的dsRNA的细菌喂食线虫,结果线虫表现出类似unc-22缺陷的表型(11—13)。
后继的实验表明将线虫浸入dsRNA中同样可以诱导基因沉默——这种技术使得大规模筛选线虫RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能,并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究。
果蝇中的RNAi
在果蝇的研究中同样发现RNAi。
尽管采用能生产dsRNA的酵母喂食果蝇的实验失败告终,但是通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中、或者将带有反向重复序列的DNA导入果蝇中能够引发基因沉默。
在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具,用于鉴定功能缺失表型。
(19—23)
注射的RNAi如何引发基因沉默?
在过去的数年中多个研究小组进行了不懈的努力。
Baulcombe和Hamilton首先在发生协同抑制的植物中鉴定了一些在没有发生基因沉默的植物中并不存在的大约25个碱基大小的RNA,这些RNA分别与沉默基因的正义和反义链互补(24)。
这成为揭示RNAi秘密的第一条关键线索。
后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个秘密(3,25,26)。
在一系列著名的实验中,Zamore和同事发现注入果蝇细胞的dsRNA被切割为21—23碱基长短的RNA片段,他们同时发现:
与dsRNA同源的内源基因的mRNA,只在和dsRNA对应的部位被切割成为21—23核苷酸长的片断(26)。
很快,RNAi的机制越来越清楚了。
现有的RNAi机制的模型
通过生化和遗传学研究,产生了现有的RNAi作用机制模型,包括起始阶段和效应阶段(initiationandeffectorsteps,27, 点击看看Flash演示动画"HowDoesRNAiWork?
")。
在起始步骤,加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs,又被称为引导RNAs:
“guideRNAs”3,18,27),证据表明:
一个称为Dicer的酶,是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,能以一种ATP依赖的方式逐步(processive)切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19—21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片断的3'端都有2个碱基突出(27,28)。
在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC)。
激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。
激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA(3,18,27,29)。
尽管切割的精确机制现在还是未知,研究表明每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。
由于在一些生物中RNAi的影响格外显著,有人提出在RNAi途径中可能存在某个(信号)扩增的步骤。
这种扩增可能是复制外源注入的dsRNA从而产生更多的siRNA,也可能是直接扩增siRNA本身(参见下一段文字)。
这种扩增可能在RNA诱导沉默复合物(RISC)形成过程进行,作为RISC形成的补充,或者独立于RISC(3,18,27)。
RNA依赖的RNA聚合酶的潜在作用
对脉胞菌、线虫和拟南芥的基因筛查过程中鉴定了几个显然对转录后基因沉默(PTGS)和RNAi过程起关键作用的基因。
其中包括Neurosporaqde-1,ArabidopsisSDE-1/SGS-2和C.elegansego-1在内的几个基因,都是编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerases,RdRPs)的。
初步的结论,很可能就会推断这是“RNA依赖的RNA聚合酶活性是RNAi所必须的”证据。
当然,如果真的存在聚合酶扩增dsRNA或者siRNA这一步的话,RNA依赖的RNA聚合酶的存在就有助于解释何以dsRNA诱导基因沉默有如此强大作用。
但是这些基因的突变体有不同的表型,这使得在RNAi过程中RNA依赖的RNA聚合酶的作用难以确定(1,3,17,18)。
线虫C.elegansego-1(ego代表"enhancerofglp-1")突变体中,RNAi在肌肉细胞中正常出现,但在生殖系细胞中,也就是ego-1主要表达的地方,RNAi没有发生。
在拟南芥ArabidopsisSDE-1/SGS-2("SGS"代表suppressorofgenesilencing)突变体中,通过内源复制的RNA病毒引入dsRNA可以产生siRNA,但是通过转基因引入的dsRNA则不会产生siRNA。
有人推断说可能是病毒本身的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)取代了拟南芥突变体中的这些酶(1,3,17,18)。
虽然在果蝇和人类体内还未发现RdRP的类似物,近来的一篇文章报道了在果蝇胚胎细胞中发现RdRP活性(30)。
一种称为随机降解PCR“randomdegradativePCR”的模型认为:
RdRP以siRNA为引物扩增模版mRNA,产生dsRNA底物提供给Dicer酶,结果产生更多的siRNA。
在线虫的实验中找到了支持这种模型的证据(27,30),但是同样在果蝇胚胎细胞的实验结果则反驳了这种理论模型(26,27)。
RNAi的起始
两个线虫基因,rde-1和rde-4(“rde”代表“RNAideficient”)据信是参与RNAi的起始步骤。
这些基因的突变体线虫即使注入dsRNA也不会出现基因沉默,但是如果没有沉默缺陷的杂和亲代将siRNA传递到这种突变体中则会引发基因沉默。
线虫rde-1基因属于一个大的基因家族,和脉胞菌qde-2(“qde”代表"quellingdeficient")、拟南芥ago1基因(“ago”代表“argonaute”,早前被鉴定参与拟南芥的发育)同源,尽管这些基因在转录后基因沉默(PTGS)中的作用不明,RDE-1家族在哺乳动物中的一个成员已经被证实是一个翻译起始因子。
有趣的是拟南芥中的AGO1突变体表现为协同抑制缺陷的同时也表现为叶发育缺陷。
所以,PTGS相关的一些酶或者过程可能参与发育过程(1,3,17,18)。
RNAi的效应物
转录后基因沉默(PTGS)的效应步骤的重要基因包括线虫rde-2和mut-7基因。
这些基因首先是在一种杂和突变体线虫中发现的,这种杂和突变体不能将RNAi传递给他们的纯和子代。
有这两个基因突变的线虫表现为RNAi缺陷,但是引人注意的是他们同时表现出转座子活性提高。
因此保持转座子沉默的某种机制看来与RNAi和PTGS相关。
尽管rde-2基因产物还未经识别,mut-7编码的蛋白有着和RNaseD的核酸酶结构域同源的区域,以及一个人类Werner综合症(一种快速老化的疾病)中出现的蛋白的同源区域(1,3,17,18,31)。
这个蛋白有可能是降解靶RNA所需要的核酸酶。
PTGS有着古老的根源
从遗传和生化的角度分别进行的研究同样指出转录后基因沉默(PTGS)可能在生命进化的早期就存在。
有人提出转录后基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子或RNA病毒的防御机制,可能在植物和动物分化之前就已经出现(1,3,17,18)。
有趣的是,许多研究人员都注意到:
破坏RNAi相关的基因通常导致严重的发育缺陷,这个发现提示RNAi与至少一个发育过程有着某种联系。
一组小分子RNA,就是smalltemporalRNAs(stRNAs),可以通过对特定目标转录本的翻译抑制来调控线虫的发育时钟,研究结果表明:
线虫lin-4和let-7stRNAs是由那些大约70个碱基的转录产物折叠成茎环节构后形成的。
折叠的RNA分子被Dicer酶(在线虫中称为DCR-1)切割成为22个碱基的stRNAs,Dicer酶可以产生siRNAs和stRNAs,表明RNAi和stRNA途径有一个交叉点(32-34)。
最近,在果蝇、线虫和Hela细胞中有大约100个新的大约22个碱基的小分子RNA——microRNAs(miRNAs)被鉴定出来(35-38),就像lin-4和let-7,这些miRNAs是在RNA前体分子折叠成茎环二级结构后形成的,这些新发现的大约22个碱基大小的miRNAs被认为是在基因表达调控过程中起某种作用。
其中至少有两个的产生已知需要Dicer酶参与(37)。
显然,在进化的过程中,利用小分子RNA调控基因表达和RNAi有共通之处。
由长dsRNA引起的非特异基因沉默
在各种生物中(植物、原生动物、昆虫、线虫)中陆续发现了自然存在的RNAi现象,哺乳动物细胞中存在RNAi的证据则费了一番功夫才找到。
将较长的双链RNA(超过30个碱基对)转染哺乳动物细胞会引起非特异的基因表达抑制,这和在其他生物中的特异抑制不同,这种抑制可能由于一种抗病毒应答反应,是通过以下两种途径之一进行的。
其中一条途径,长的dsRNA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通过一系列的磷酸化使翻译起始因子eIF2a失活,导致翻译抑制(39)。
在另外一个途径中,长dsRNAs激活RNaseL,导致非特异的RNA降解(40)。
多个研究小组证实在小鼠胚胎干细胞和至少一个胚胎来源的细胞株中没有dsRNA介导抗病毒应答(41,42)。
因此可能用长dsRNAs在这些特定的细胞中诱导特定的基因沉默。
然而抗病毒应答使得我们无法在多数其他哺乳动物细胞中用长dsRNAs诱导RNAi。
siRNA克服了抗病毒应答的障碍
有趣的是不超过30个碱基的双链RNAs并不会激活PKR激酶途径。
这个发现,再加上已知在线虫和果蝇中长dsRNAs会被切割成siRNAs、而siRNAs会诱导RNAi,促使研究人员研究用siRNAs是否能诱导哺乳动物细胞的特定的基因沉默(43)。
的确,通过瞬时转染导入的siRNAs能够以序列专一的方式有效诱发培养的哺乳动物细胞的RNAi。
siRNAs的效率各有区别——最有效的siRNAs能使靶RNA和蛋白水平降低90%以上(44-46)。
最有效的siRNAs是21个碱基大小、3'端有两个碱基突出的双链RNA。
siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果(44,47)。
不过,并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚,可能是位置效应(positionaleffects46,48,49)的结果,设计siRNA可以参考“siRNADesign”。
尽管RNAi和PTGS的历史和机制都很吸引人,但是大多数研究人员最感兴趣的是RNAi可以作为功能基因组研究领域中的有力工具。
现在,在果蝇、线虫和一系列植物的研究中,RNAi技术已经广泛应用于探讨许多基因功能的研究中。
由于已知通过转染siRNAs可以在哺乳动物细胞中诱发RNAi,更多的研究人员开始用RNAi作为一种工具研究人类、小鼠和其他哺乳动物的细胞。
在较早的哺乳动物RNAi实验中,siRNAs是通过化学方法合成的,现在有多家公司提供通过体外转录的方法合成siRNA的试剂盒,比如Ambion的Silencer™siRNAConstructionKit,NEB公司的HiScribe™RNAiTranscriptionKit等等(后文介绍)。
体外转录制备siRNA是比较经济的方法,特别是有多个siRNAs需要合成的时候,通过瞬时转染可以将这些siRNAs转入细胞内,由于不同的siRNAs效果不同,根据一个靶基因研究人员通常需要设计3—4个不同的siRNAs进行试点实验以确定最有效的一个(44-46,48,49)。
到目前为止,注射和转染dsRNA到细胞或者生物体内是运送siRNAs的主要方式。
虽然基因沉默效应可以持续好几天,也确实有例子可以传给子代细胞,但最后还是会消失的。
最近,有几个研究小组开发一种表达载体,能够在瞬时转染和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达siRNAs(50-56),一些载体经过设计可以表达smallhairpinRNAs(shRNAs),在体内加工后形成类似siRNAs的分子,能够引发基因沉默。
载体的polIII启动子(polymeraseIII)和一个有4—5个T的转录终止位点之间插入shRNA序列,转录产物在转录终止位点的第二个碱基处终止,(polIII转录产物是没有poly(A)尾巴的),然后折叠成茎环结构(3'末端有两个U的突出端),最后shRNAs在体内被加工处理,成为大约21个碱基大小的类似siRNA的分子,随后起始RNAi过程(50)。
这个发现和最近在线虫和果蝇、植物以及锥虫中先后进行的将能形成茎环结构的RNA分子导入能够引发RNAi现象的结果是一致的(reviewedin3)。
另外还有一类由不同的研究小组开发的表达载体,在独立的polIII启动子后插入正义和反义的siRNA序列,这个载体上的siRNA就像前面介绍的shRNAs一样都有5个T的转录终止位点。
这两类表达载体的产物引发RNAi的效果和瞬时转染siRNA的效果相当。
在哺乳动物细胞中用siRNA能高效阻断某个特定基因的表达,这项技术在疾病的基因治疗上也有光明的应用前景。
特别可以用于阻断某些突变基因的表达,或者由蛋白过量表达引起的疾病。
最近在RNAi领域的研究成果已经在整个研究领域引起了巨大的反响。
由于能够迅速而简单的制备某个功能缺失表型,使得更多的研究人员迫不及待地投身于RNAi的研究之中,去尽可能地了解RNAi和有效的siRNAs的特征。
将来,RNAi甚至将会给基因治疗(gene-specifictherapeutics)的发展带来新的希望。
尽管目前对这项功能强大的技术已经有深入的了解,但是几乎每天都有新的结果不断涌现(生物通将及时为您追踪这个领域的最新进展)。
可以毫不夸张的说,RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐。
GlossaryofTerms
Cosuppression-Silencingofanendogenousgenecausedbytheintroductionofatransgeneorinfectionbyavirus.Thisterm,whichcanrefertosilencingatthepost-transcriptional(PTGS)ortranscriptional(TGS)level,hasbeenprimarilyadoptedbyresearchersworkingwithplants.
Post-transcriptionalGeneSilencing(PTGS)-SilencingofanendogenousgenecausedbytheintroductionofahomologousdsRNA,transgeneorvirus.InPTGS,thetranscriptofthesilencedgeneissynthesizedbutdoesnotaccumulatebecauseitisrapidlydegraded.ThisisamoregeneraltermthanRNAi,sinceitcanbetriggeredbyseveraldifferentmeans.
Quelling-PTGSinNeurosporacrassainducedbytheintroductionofatransgene.
RISC-RNA-inducedsilencingcomplex.Anucleasecomplex,composedofproteinsandsiRNA(seebelow),thattargetsanddestroysendogenousmRNAscomplementarytothesiRNAwithinthecomplex.
RNAinterference(RNAi)-Post-transcriptionalgenesilencing(PTGS)inducedbythedirectintroductionofdsRNA.Theterm"RNAinterference"wasfirstusedbyresearchersstudyingC.elegans.
siRNAs-SmallinterferingRNAs.CurrentmodelsofPTGSindicatethatthese21-23nucleotide
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