分子生物学操作考核试题及评分标准模板.docx
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分子生物学操作考核试题及评分标准模板.docx
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分子生物学操作考核试题及评分标准模板
分子生物学操作考核试题及评分标准
实验一:
质粒DNA的提取和纯化
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10
四
进行实验:
1、实验准备:
制备含有相应抗生素的固体和液体LB培养基,将保存的菌液涂布到固体培养基平板上培养单菌落(1~2天)。
(5分)
2、挑取单菌落在含有对应于某一抗生素(如Amp或Kan)的LB培养液(25mL)中接种,37℃振荡培养过夜,使细菌处于对数生长期(约12-16个小时)。
(5分)
3、吸取10mL培养液于eppendorf管中,12000rpm离心5分钟,弃去上清液,可用微量移液器适当吸取残余上清。
细菌沉淀于管底。
(5分)
4、加入1mL溶液Ⅰ,用手指或涡旋振荡器剧烈弹震,使菌体充分悬浮,室温下静置5min。
(5分)
5、加入2mL新配制的溶液Ⅱ,盖紧管盖,上下温和颠倒eppendorf管2-3回,以混匀内容物(千万不要剧烈振荡),冰浴静置5min。
(5分)
6、加入1.5mL浴冷的溶液Ⅲ,上下颠倒混匀数次,冰浴条件下静置5min。
(4分)
7、12000rpm离心10min,将上清液移至新的eppendorf管中(约400µL)。
(4分)
8、加入等体积的酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),充分振荡混匀,12000rpm离心5min。
(5分)
9、吸取上层水相至新的离心管中,加入十分之一体积量的3mol/L的pH5.2NaAc,再加入2倍体积(约1 mL)的预冷的无水乙醇。
(5分)
10.放入-20℃冰箱中静置30分钟,12000rpm离心15min。
(4分)
11.弃去上清,加入1mL预冷的70%乙醇,12000rpm离心5min,洗涤沉淀。
(5分)
12.弃去上清,沉淀在室温下自然干燥。
然后加入40µLTE溶液。
(4分)
13.取5µL的质粒与2µL的6X上样缓冲液混合后,在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
(5分)
14.将所获得的质粒DNA样品置于4℃冰箱中备用。
(4分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10
实验二:
DNA浓度和纯度的测定
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10
四
进行实验:
1、吸取5µLDNA样品,加水至1ml混匀后,转入分光光度计的石英比色杯中。
如果样品很少,可以用0.5ml的比色杯,上述核酸样品与水的用量缩小一半。
(16分)
2、先用1ml水对分光光度计校正为零点。
(5分)
3、在260nm和280nm分别读出光密度,DNA样品的浓度我OD260×核酸稀释倍数×50/1000;RNA样品的浓度OD260×核酸稀释倍数×40/1000;浓度单位为μg/µL。
按步骤1的稀释方式,DNA或RNA的浓度(μg/µL)均为OD260的10倍;如OD260为0.1,则样品的浓度就为1μg/µLDNA或RNA。
这样稀释倍数非常便于计算。
(26分)
4、若为DNA样品,OD260/OD280比值大于1.8,说明仍存在RNA,可以考虑用RNA酶处理样品;小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚/氯仿抽提,用乙醚抽提后,以乙醇沉淀纯化DNA。
RNA样品OD260/OD280比值小于2,也应该考虑再用酚/氯仿抽提(18分)。
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验三:
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、准备好制胶板,封边防漏。
(6分)
2、根据所需浓度称取一定量的琼脂糖,加入适量的0.5×或1×TBE或其它电泳缓冲液,微波炉加热或沸水裕使琼脂糖溶解。
(8分)
3、等凝胶温度降到55℃~60℃时,加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5µL/ml,摇匀。
(7分)
4、将琼脂糖倒入制胶板中,凝胶厚度一般为0.3~0.5cm,迅速插上梳子,检查有无气泡。
(5分)
5、凝胶充分凝固后,小心取出梳子,并撤除两端封边挡板。
(5分)
6、将凝胶放置于电泳槽中,加入相应的电泳缓冲液,使液面略高于胶面。
(5分)
7、在DNA样品中加入1/6的上样缓冲液,混匀后,稍离心,然后用移液器将DNA样品加入样品孔中。
(8分)
8、接通电源,选择适当电压和电泳方向,使DNA样品由负极向正极电泳。
(7分)
9、当指示剂接近凝胶末端时,切断电源,停止电泳。
(8分)
10、取出凝胶,在紫外灯下观察,摄像。
(6分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验四:
PCR扩增获取目的基因
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、取一个0.2mL的eppendorf管,在其中添加以下各种成分。
a)模板DNA(质粒PUCATPH)2.5µL
b)引物Doc1F0.5µL
c)引物Doc1R0.5µL
d)10XBuffer2.5µL
e)dNTP2µL
f)ddH2O17µL
g)Taq酶(5U/µL)0.2µL
总体积25µL(10分)
2、稍离心。
(5分)
3、将反应管放入PCR热循环仪,按下列条件设计程序,进行PCR反应。
a)预变性94℃3min
b)变性94℃50sec
c)退火62℃50sec30个循环
d)延伸72℃1.2min
e)补充延伸72℃10min
f)保存10℃forever(15分)
4、反应结束后,取8µL反应液与2µL上样缓冲液混合后用1.0%琼脂糖凝胶电泳,以DNAmarker做标准对照,鉴定PCR产物是否存在以及大小。
(10分)
5、将三个PCR反应产物混合在一个管子中,然后添加1/10体积的3mol/L的pH5.2NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇,-20℃冰箱中放置30min以上。
12000rpm离心5分钟,将eppendorf管倒置于吸水纸上,室温干燥5分钟。
(15分)
6、30µLTE溶解沉淀,电泳确认回收PCR产物。
(10分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验五:
DNA酶切
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1在0.5mLeppendorf管中加入下列成分
APCR回收产物(目的基因):
ddH2O7µL
回收产物10µL(约1µg)
10X通用Buffer2µL
HindⅢ(10U/µL)0.5µL
BamHⅠ(10U/µL)0.5µL
总体积20µL
BpBSKS质粒酶切
ddH2O7µL
pBSKS质粒10µL(约2µg)
10X通用Buffer2µL
HindⅢ(10U/µL)0.5µL
BamHⅠ(10U/µL)0.5µL
总体积20µL(35分)
2混匀,稍离心,在37℃反应2-4小时,或过夜。
(10分)
3加入反应终止液以终止酶切反应(一般可省略)(10分)
4取10µL酶切反应液,加入3µL上样缓冲液,然后进行琼脂糖凝胶电泳,参照标准分子量marker,回收目的条带。
(10分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验六:
目的DNA的回收
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、通过琼脂糖凝胶电泳将目的片断与其它DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下含需回收的琼脂块,放入1.5mL离心管中。
判断DNA片断的位置时,要尽可能使用长波长紫外光,在紫外光下照射的时间尽可能短。
(9分)
2、按400µL/100mg琼脂糖凝胶的比例加入BindingBufferⅡ,置于50~60℃水浴中10分钟,使胶彻底融化。
加热融胶时,每2分钟混匀一次。
(8分)
3、将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2分钟。
8000rpm室温离心1分钟。
(8分)
4、取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入到同一个收集管中,加入500µLWashsolution,8000rpm室温离心1分钟。
(8分)
5、重复步骤4一次。
(8分)
6、取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管中,12000rpm室温离心15秒。
(8分)
7、将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL离心管中,在柱子膜中央加入40µLElutionBuffer或水(ph>7.0),室温或37℃放置2分钟。
(8分)
8、12000rpm室温离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片断,可立即使用或存放于-20℃备用。
(8分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验七:
目的基因与载体的体外连接
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1在一个0.5mL的eppendorf管中加入2µL酶切后的载体与6µL目的基因片断。
(10分)
2添加1µL的10X连接buffer以及1µL的T4DNA连接酶
即PCR产物6µL
酶切质粒(pBSKS)2µL
10X连接buffer1µL
T4DNA连接酶1µL
总体积10µL(25分)
3混匀后3000rpm短暂离心将液体全部甩到管底。
(10分)
416℃条件下保温过夜或4℃过夜。
(10分)
5连接产物用于转化感受态细胞。
(10分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验八:
大肠杆菌感受态细胞的制备
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、从大肠杆菌DH10B平板上挑取一个单菌落接于2ml的LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
(8分)
2、取0.5ml菌液转接到一个含有50ml的LB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养2~3h,此时,OD60≤0.4~0.6,细胞数务必<108/ml,此为实验关键(8分)
3、将菌液转移到50ml离心管中,冰上放置10min,使培养物冷却至0℃。
4、离心10min(4000r/min),回收细胞。
(9分)
5、倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽。
6、用冰冷的0.1mol/L10ml悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。
(8分)
7、0~4℃,4000r/min,离心10min回收细胞。
(8分)
8、用冰冷的0.1mol/LCaCl22ml悬浮细胞(务必放冰上)(8分)。
分装细胞,每200µL一份。
此细胞为感受态细胞(8分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验九:
大肠杆菌感受态细胞的转化
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、1制备含有Amp的LB培养基平板。
(9分)
2、取一管100µL的感受态细胞(如果是冰冻的则需要在冰上化冻后,进行操作),加入重组质粒(质粒与目的基因)的连接产物5µL(不要超过5µL),轻轻用枪吹打均匀。
(10分)
3、置冰浴中20min。
(9分)
4、然后42℃保温90sec或37℃保温5min,迅速放入冰中,冰浴3-5min(9分)
5、添加1mL的LB培养基,37℃振荡培养1hou。
(9分)
6、3000rpm离心5min,弃去上清,余下全部样品(约0.1µL)用枪轻轻吹匀,吸至含有Amp抗生素的LB培养基上,另添加20µL20mg/mL的X-gal和40µL100mmol/L的IPTG,均匀涂布。
(10分)
7、培养基正面放置37℃培养箱中30min后,倒置培养16个小时。
(9分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验十:
重组子的筛选
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、将含有重组子的并活化后的菌液均匀涂布于含Amp抗生素的并添加X-gal和IPTG的LB培养基上,培养至蓝/白斑出现。
(35分)
2、观察平板上长出的抗性菌落(转化子),有白色菌落和蓝色菌落,白色菌落可视为重组子,蓝色菌落为非重组子。
统计蓝、白斑的比例。
(30分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验十一:
PCR鉴定重组子
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、按照蓝白斑筛选法,挑取白色单菌落接入1.5mL含抗生素的LB液体培养基中,37℃振荡培养三个小时,取出2µL菌液作为模板进行PCR反应,反应体系其它成分同实验4。
剩余菌液继续振荡培养至对数期,4℃保存备用。
(40分)
2、PCR产物电泳,以目的基因片断作为对照,确认出正确插入的重组质粒。
(25分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
实验十二:
酶切鉴定重组子
步骤
考核目标及评分细则
满分值
一
1.明确实验目的(2分)
2.理解实验原理(3分)
5分
二
1.选择恰当的药品和仪器(2分)
2.熟悉药品的配制(3分)
5分
三
1.熟悉实验步骤(5分)
2.清除实验注意事项(5分)
10分
四
进行实验:
1、转化后的细胞在含有抗生素的LB平板上,培养过夜后,在平板上会长出许多抗性菌落(转化子),其中有白色菌落(可视为重组子)和蓝色菌落(可视为非重组子)。
(10分)
2、挑取白色单菌落接入5mL含抗生素的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
(11分)
3、取1.5mL菌液提取质粒(具体方法见实验1),另取0.5mL菌液至一新的eppendorf管,于4℃保存备用。
(11分)
4、电泳检测提取出来的质粒。
(11分)
5、按如下体系建立酶切反应(11分)
H2O7µL
重组质粒10µL(约2µg)
10X通用Buffer2µL
HindⅢ(10U/µL)0.5µL
BamHⅠ(10U/µL)0.5µL
Totalvolume20µL
37℃保温1hou。
6利用空载体与目的基因片断作为对照,对酶切后的重组质粒进行电泳,从酶切后的片断的数目及大小上进行确认。
(11分)
65分
五
根据实验结果得出结论
5分
六
实验后整理:
1、废液倒入废液桶,固体物回收到指定容器中(5分)
2、洗涤仪器并使其归位。
(3分)
3、保持台面和地面整洁,实验后洗手。
(2分)
10分
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