氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库.docx
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氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库
青岛科技大学
硕士学位论文
氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学
姓名:
李小青
申请学位级别:
硕士
专业:
分析化学
指导教师:
孙伟
20090608
青岛科技大学研究生学位论文
氧化还原蛋白质在离子液体屋内米材料复合体系中的直接电
化学
摘要
本论文主要研究目的在于构造和发展性能优良的以直接电化学为基础的第
三代生物传感器。
血红素蛋白质是一种氧化还原蛋白质,研究其直接电化学对于
研究生命体内的电子转移过程,了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检
测方法等方面具有非常实际的意义。
纳米粒子由于其独特的光学、电学、催化等
性质,在修饰电极上的应用研究已经引起人们极大的关注。
近年来,室温离子液
体逐渐成为研究的热点。
本论文主要开展了以下几个方面的研究工作:
1.制备了3种离子液体修饰碳糊电极。
以室温离子液体1.丁基.3.甲基咪唑
六氟磷酸盐(BMIMPF6)、六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)和1.乙基一3.甲基咪唑四氟
硼酸盐(EMIMBF4)等为粘合剂和修饰剂,与石墨粉相混合制备了新型的离子液体
修饰碳糊电极(CILE)。
’
2.开展了血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(m)在CILE上的直接电化学行为研究。
分
别以上述3种CILE为基底电极,以Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米
管(SWCNTs)、聚乙烯醇(PVA)、纳米Ti02、壳聚糖(CTS)等为修饰材料,采用
层层涂布法、直接混合法等固定方法,将Hb和Mb固定到不同电极的表面制备了
不同类型蛋白质电化学生物传感器,如De/Hb/CILE、CTS/nano.Ti02/Hb/CILE、
Nafion/Hb/SWCNTs/CILE、PVA/Hb/MWCNTs/CILE、Nafion/Mb/MWCNTs/CILE、
Nation.BMIMPF6/Hb/CILE。
考察了Hb和Mb在不同修饰膜电极上的直接电化学和
电催化行为。
采用扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外
光谱和多种电化学法对修饰电极的性质进行了研究和表征。
实验结果表明,Hb
和Mb在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性,循环伏安扫描出现一对准可逆的
氧化还原峰,并且在修饰电极上lib和Mb的电子传递能力明显增强,纳米粒子和
离子液体的存在提供了一个合适的微环境,对电化学行为有极大的促进作用,对
Hb和Mb的直接电化学行为进行了研究,求解了相关的电化学参数。
解释了电化
学行为的机理,进一步研究了该修饰电极对H202、三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠
(NAN02)等小分子的电催化性质,实验结果表明所制备的胁和Mb修饰电极表现出
良好的电催化性能,求解了相应的表观米氏常数(KMapp)。
3.开展了lib在纳米Ti02中的直接电化学行为研究。
以BPPF6修饰的碳糊电极
氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学
为基底电极,采用静电吸附的方法将Hb固定到电极表面上,制备了Hb修饰电极
(nano—Ti02/Hb/CILE)。
考察了Hb在电极上的直接电化学和电催化行为。
实验结果
表明,Hb在nano.Ti02膜内能够保持其原始构象,循环伏安扫描出现一对准可逆的
氧化还原峰。
对Hb的直接电化学行为进行了研究,求解了相关的电化学参数。
关键词:
氧化还原蛋白质,室温离子液体,直接电化学,电催化,碳糊电极,
生物传感器,纳米粒子
II
青岛科技大学研究生学位论文
DIRECTELECTROCHEMISTRYOFREDOXPROTEINS
INIONICLIQUIDANDNANOPARTICLESMATERIAL
COMPOSITEFILMS
ABSTRACT
Inthisdissertation,thethird-generationelectrochemicalbiosensorsbasedon
directelectrontransferbetw.eentheproteinsandtheunderlyingelectrodeswere
fabricatedanddeveloped.Hemeproteinsareakindofredoxproteins.Studiesonthe
directelectrochemistryofredoxproteinscanbeusedfortheunderstandingofthe
mechanismsofelectrontransferreactionsandoxidation/reductioninlifeprocesse,
whichcallalsobeproposedasasensitivemethodforproteinsdetermination.Dueto
theuniqueoptical,electricalandcatalyticcharactersofnanoparicles,nanoparticles
haveattractedmuchattentionfortheirnovelapplicationsinthemodifiedelectrodes.
Roomtemperatureionicliquids(RTILs)haveexcellentphysicalandchemical
properties.Themainpointsofthethesisaresummarizedasfollows:
1.Threeroomtemperatureionicliquids(RTILs)modifiedcarbonpasteelectrodes
(CPE)wereconstructedbasedonthesubstituteofparaffinwith
1-butyl-3-methylimidazoliumhexatiuorophate(BMIMPF6),N-butylpyrifinium
hexafluorophosphate(BPPF6)or1-ethyl·-3··methylimidazoliumtetrafluoroborate
(EMIMBF4)tomixwithgraphitepower.
2.Thedirectelectrochemistryofhemoglobin(wo)andmyoglobin(Mb)onthe
carbonionicliquidelectrode(CILE)werecarefullystudied.HbandMbwere
immobilizedonthesurfaceofCILEwithNationandpolyvinylalcohol(PVA)filmor
Nafion/MWCNTsfilmbystep—by-stepmethod.ThecharacteristicsofHbandMbin
thesemodifiedfilmswereinvestigatedbyscanelectronmicroscopy,UV-Visspectrum,
FT.IRspectrumandelectrochemicalmethods.TheresultsshowedthatHbandMbin
Ili
氧化还原蛋向质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学
thesefilmsretaineditsnatives咖cnlre.Apairofwell,definedandquasi—reversible
cyclicvoltammetricpeaksappeared.Nanoparticlesandroomtemperatureionicliuqids
couldprovideafavorablemicroenvironrnentandenhancedirectelectrontransferrate.
TheelectrochemicalbehaviorsofHbandMbinthemodifledelectrodewerecarefully
investigatedwiththeelectrochemicalparameterscalculated.TheHbandMbmodifled
electrodeshowedexcellentelectrocatalyticbehaviorstothereductionofhydrogen
peroxide(H202),trichloroaceticacid(TCA)andsodiumnitrite(NaN02),Theapparent
Michaelis.Mentenconstants(KM8pp)ofthesensorswerecalculated.
3.ThedirectelectrochemistryofHbwithTi02nanoparticlewascarefullystudied
onthecarbonionicliquidelectrode(CILE),whichwasfabricatedbyusing
N—butylpyridiniumhexafluorophosphate(BPPF6).Hbwasimmobilizedonthesurface
ofCILEwithTi02nanoparticlebyadsorptionmethod.Thedirectelectrochemistryand
electrocatalysisofHbinmodifiedfilmwasinvestigated.TheresultsshowedthatHbin
thefilmretaineditsnativestructure.Apairofwell.definedandquasi-reversiblecyclic
voltammetricpeaksappearedandtheelectrochemicalparameterswerefurthur
calculated.
KEYWORDS:
redoxproteins,roomtemperatureionicliquids,direct
elelctrochemistry,electrocatalysis,carbonionicliquidelectrode,biosensor,
nanoparticles
W
青岛科技大学研究生学位论文
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本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的
研究成果。
据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含
其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或
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与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文
中作了明确的说明并表示谢意。
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本人签名:
套小南签字日期:
刃呵年/月扩日
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科技大学。
(保密的学位论文在解密后适用本授权书)
本学位论文属于:
保密口,在年解密后适用于本声明。
不保密口。
本人签名:
导师签名:
考^j\禹
汐·唧
1
日期:
幻口7年石月8-E1
日期:
二秒口7年石月莎日
青岛科技大学研究生学位论文
帚第一早章义文献陬琢综怂述
1.1血红素蛋白质简介
氧化还原蛋白质是一类具有氧化还原性质的蛋白质,可以接受或给出电子,
在其氧化态和还原态之间转换。
血红素蛋白质是一类含有血红素辅基的蛋白质。
血红素(heme)又叫铁卟啉,是由原卟啉(protoporphyrin)与铁(II)组成,又称铁一
原卟啉IX(Fe.protoporphyriniX),是一种以多种氧化态或还原态存在的分子,其
结构如图1-1所示【l】。
血红素辅基通常都是血红素蛋白质电活性基团。
血红素蛋
白质在电极上的直接电化学实质上就是其中的血红素辅基与电极间的电子转移
反应。
常见的氧化还原蛋白质主要有:
肌红蛋白(Mb)、血红蛋白(Hb)、辣根过
氧化物酶(HI心)、细胞色素C(CytC)等。
C
图1.1血红素的化学结构
Fig.1-1Chemicals缸ucn∽ofheme
1.1.1血红蛋白
血红蛋(Hemoglobin,Hb)是高等生物体内负责运载氧的一种氧化还原蛋
白质。
分子量约为64,500,等电点为7.4【2】,分子尺寸为6.5x5.5x5.0nm【3】。
人
体内I-Ib是由四个亚基构成,分别为两个a和两个p亚基。
Hb的每个亚基由一
条肽链和一个血红素分子构成,肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形,把血红
素分子围绕在里面,这条肽链盘绕成的球形结构称为珠蛋白。
血红素分子中有
一个具有卟啉结构的小分子,在卟啉分子中心,由卟啉中四个吡咯环上大的氮
氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学
原子与一个亚铁离子配位结合,珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲
哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合,当Hb不与氧
结合的时候,有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合,而当Hb载氧
的时候,就由氧分子顶替水的位置。
1.1.2肌红蛋白
肌红蛋I兰t(Myoglobin,Mb)位于肌肉的肌细胞中,其功能主要是储氧和载
氧。
Mb是由一条多肽链和一个血红素辅基构成的中等大小的单链蛋白质,其
分子量约17,800,等电点为6.8E41。
Mb的多肽链由153个氨基酸残基组成,X
射线衍射研究表明,Mb中的多肽链70%是以0【螺旋形式存在的。
链中的极性
的氨基酸残基几乎全部分布在分子表面,使Mb具有水溶性;而非极性的氨基
酸残基分布在分子的内部,使得内部成一个疏水空腔,血红素几乎整个包埋在
这个空穴中。
血红素卟啉环中心的铁原子有6个配位键,其中4个键与卟啉环
上的N配位,形成一个平面,第5轴向配位键与肽链的组氨酸咪唑相联,第6
轴向配位键或者空着,或者结合氧。
故Mb的重要生理功能之一是储存和运载
氧分子。
1.2蛋白质的直接电化学研究进展及研究意义
生命过程离不开电子传递,无论是能量转换,还是神经传导;无论是光合
作用,还是呼吸过程甚至是生命的起源、大脑的思维、基因的传递都与电子传
递密切相关。
研究生命过程很重要的一个方面就是研究生物体内的电子传递过
程【5J。
蛋白质是~类重要的生物大分子,研究氧化还原蛋白质在电极表面的电
子传输过程对于了解生命体内的物质代谢和能量转换、了解生物分子的结构和
各种物理化学性质、探索其在生命体内的生理作用及作用机制、开发新型第三
代生物传感器和生物燃料电池以及生物电子学等均具有重要意义。
由于多数蛋白质的分子量较大,结构复杂,其电活性基团或氧化还原中心
深埋在多肽链内部,与电极表面距离较远,因此,溶液中的氧化还原蛋白质与
电极直接交换电子非常困难,并且直接电子传输的机理也非常复杂,同时与蛋
白质在电极表面的构象和定位等很多因素有关,同时溶液中的大分子杂质在电
极表面的吸附和蛋白质本身的吸附变性也会阻碍蛋白质与电极间的直接电子转
移【61。
20世纪90年代以来,为了实现蛋白质和电极之间有效的直接电子传递,
人们进行了大量研究,一个比较有效的方式是将蛋白质通过薄膜修饰电极固定
2
青岛科技大学研究生学位论文
在电极表面,因此薄膜修饰电极为蛋白质的直接电化学研究提供了一个新的思
路。
1.2.1蛋白质的固定方法
为了研制价格低,灵敏度高,选择性好和寿命长的生物传感器,蛋白质固定
化技术显得非常重要。
主要包括物理吸附法,共价键合法,化学交联法,包埋法,
夹心法等。
现己报道的较为成熟的固定方法可归纳如下【7】。
1.2.1.1物理吸附法此法是通过蛋白质的极性键、氢键、疏水键的作用将生物组
分吸附于不溶性的惰性载体上,常用的惰性载体如石墨粉、活性碳、分子筛等。
物理吸附法的特点是方法简便、操作条件温和,对生物活性影响小,缺点是蛋白
质与固体表面结合力比较弱,容易导致蛋白质的泄露或脱附,从而造成传感器的
稳定性和重现性差,而且蛋白质暴露在外,容易受温度、pH、离子强度等环境因
素的影响,因此使用寿命无法满足实际要求。
1.2.1.2共价键合法将蛋白质通过共价键与载体表面结合而固定的方法称为共价
键合法。
该方法是将基体表面进行活化处理,然后与蛋白质偶联,从而使生物组
分结合到基体表面。
该法的优点是通过形成共价键将蛋白质固定,相对比较稳定,
不易发生脱附。
但是容易导致灵敏度降低或蛋白质失活,操作复杂,耗时,成本
高。
1.2.1.3化学交联法使用戊二醛等双功能团试剂,使蛋白质以共价键交联在固体
表面。
该法的优点是蛋白质的固定比较牢固,不易脱落。
其缺点是难以控制,形
成的蛋白质比较膨松,导致扩散阻力大,且需要的试剂量比较大,容易引起蛋白
质活性降低。
1.2.1.4包埋法包埋法将生物功能物质与生物高分子或者聚合物等溶剂混合而使
生物功能物质包埋于其中,经溶剂挥发后制成敏感膜的方法称为包埋法。
常用的
聚合物如壳聚糖、琼脂糖等,由于包埋法优点较多,而且方法简单,操作简便,
因而在生物传感器的构造中得到了广泛应用。
1.2.1.5夹心法此法是将蛋白质封闭在双层滤膜或电极/滤膜之间,这种方法可以
为蛋白质分子提供一个相对封闭的微环境,对提高蛋白质分子的稳定性能发挥比
较积极的作用,这种方法主要用于蛋白质反应器和早期的传感器中。
3
氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学
1.3蛋白质修饰电极的类型
利用薄膜修饰电极来研究氧化还原蛋白质,为蛋白质的直接电化学研究开
辟了新的方向【8’9】。
这里被研究的蛋白质不是处于溶液相中,而是处于修饰电极
的表面的薄膜中。
在薄膜所提供的不同于水溶液的独特而有利的微环境中,氧
化还原蛋白质往往可以与电极进行直接快速的电子交换,从而表现出良好的电
化学行为,避免了由于引入外界媒介体而给电极反应带来的复杂性与局限性。
同时,薄膜修饰电极中,蛋白质和酶的用量极微,这为蛋白质的直接电化学研
究提供了极大的便利。
按照薄膜材料不同,可将蛋白质薄膜电极分为双层类脂膜【8】,表面活性剂
薄膜[101,聚合物水凝胶薄膜㈣121,复合物薄膜【13】,天然高分子薄膜‘141,纳米粒
子薄膜【15】等不同类型。
按照对电极修饰方式不同,薄膜电极可以分为涂布型薄膜、溶胶一凝胶薄膜、
Langmuir·Blodgett(LB)膜、自组装膜(SAMs)、双层类脂膜(BLMs)、层层组装
(Layer—by-LayerAssembly)薄膜等。
1.4纳米材料及其在生物传感器中的应用
纳米材料可以广泛地应用于生物医药领域,如进行细胞分离、细胞染色等,
正是由于纳米材料具有上述一系列优异特性及广阔的应用前景,系统地研究和
开发新型纳米材料具有重要的实际意义,同时深入研究纳米材料的各种物性及
其微观结构的内在联系对于进一步促进低维固体物理的发展也具有深刻的理论
意义。
要实现蛋白质和电极之间比较有效的直接电子传递,就要构造一个合适
的薄膜电极界面,因此构建膜的物质的选择非常重要,各种新型成膜材料和物
质也不断被应用于蛋白质薄膜电极的制备。
由于本论文采用了纳米材料和室温
离子液体两类物质,因此将两种类型的材料及其在蛋白质的直接电化学和生物
传感器方面的应用进行简单的介绍。
1.4.1纳米材料简介
广义地讲,纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围
(1.100nm)或由它们作为基本单元构成的具有特殊性能的材料【16】。
由于纳米结
构单元的尺度与物质中的许多特征长度,如电子的德布洛意波长、超导相干长
度、隧穿势垒厚度、铁磁性临界尺寸相当,从而导致纳米材料的物理、化学特
性既不同于微观的原子、分子,也不同于宏观物体,从而把人们探索自然、创
4
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造知识的能力延伸到介于宏观和微观物体之间的中间领域。
1.4.2纳米材料的特性
一般来说,纳米材料有以下几个特征【17】:
(1)小尺寸效应。
当超微粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的
相干长度或透射深度等特征尺寸相当或更小时,周期性的边界条件将破坏声、
光、电磁、热力学等特性均会呈现新的效应IiPd,尺寸效应。
这就是纳米粒子的
小尺寸效应(也称体积效应),是其它效应的基础,这种效应为纳米材料的具体
应用开拓了广阔的新领域。
(2)表面与界面效应。
纳米微粒由于尺寸小,表面积大,表面能高,位于表面
的原子占相当大的比例。
这些表面原子处于严重的缺位状态,因此其活性极高,
极不稳定,遇见其它原子时很快结合,使其稳定化,这种活性就是表面效应。
(3)量子尺寸效应。
当粒子尺寸下降到某一值时,金属费米能级附近的电子能
级由准连续变为离散能级的现象以及纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据
分子轨道和最低轨道能级而使能隙变宽现象均称为量子尺寸效应。
(4)介点限域效应。
随着纳米晶粒粒径的不断减小和比表面积不断增加,其表
面状态的改变将会引起微粒性质的显著变化,从而导致它比裸露纳米材料的光
学性质发生了较大的变化,这就是介电限域效应。
(5)宏观量子隧道效应。
当微观粒子的总能量小于势垒高度时,该粒子仍能穿
越这一势垒的能力,后来人们发现一些宏观量,如磁化强度、量子相干器件中
的磁通量等也具有隧道效应,称之为宏观量子隧道效应。
1.4.3纳米材料的分类
纳米微粒的特异效应,尤其是其小的尺寸和大的比表面积,使得纳米材料
具有与常规材料不同的物理的、化学的和电学的性质。
纳米材料尺寸、结构和
性质的可控性为设计新颖的传感体系和提高生物分析装置的性能提供了极好的
前景。
纳米材料种类繁多,在酶或蛋白质的直接电化学和生物传感器构造方面
用的比较多的纳米材料包括导电的纳米材料,如贵金属、碳材料和导电聚合物
和半导体纳米材料等,这些纳米材料,不论是纳米管、纳米线、纳米球还是多
孔的纳米材料,常常可以作为电极表面的修饰材料,提高对生物分子的固定量,
氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学
进而起到提高传感器性能的作用。
下面就这几种纳米材料在酶或蛋白质的直接
电化学和生物传感器方面的应用作一简单的介绍。
(1)金属纳米材料
这类材料中用的
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- 氧化 还原 蛋白质 离子 液体 纳米 材料 复合 体系 中的 直接 电化学 文库