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9研制报告
神经元特异性烯醇化酶(NSE)定量检测试剂盒
(时间分辨免疫荧光法)
研制报告
苏州新波生物技术有限公司
研制报告
1、简介
烯醇酶是参与糖酵解的关键酶,由α、β、γ三种亚基以二聚体的形式组成αα、ββ、γγ、αγ、αβ五种同工酶。
其中γγ型特异性存在于神经元和神经内分泌细胞中,称神经元特异性烯醇化酶(Neuron-SpecificEnolase,NSE),约占脑内可溶性蛋白的1.5%。
NSE广泛分布于人类及各种动物的成熟神经元、周围神经的神经内分泌细胞和一些感觉细胞中,分子量45KD。
它在正常人脑组织中含量最高,起源于神经内分泌细胞的肿瘤组织也有异常表达。
常见于神经母细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤等。
目前在临床上,NSE可作为神经元损伤的标志酶,也是小细胞肺癌(SCLC)首选的肿瘤标志物,可用于对SCLC的鉴别诊断,放化疗效果、预后、恶变情况等的监测。
肺癌大多数起源于支气管粘膜上皮。
近50年来,全世界肺癌的发病率明显增高,据统计,在欧美某些国家和我国大城市中,肺癌的发病率已居男性各种肿瘤的首位。
肺癌的病人多数是男性,男女比例约为3~5:
1,但近年来,女性肺癌的发病率也明显增加。
发病年龄大多大40岁以上。
2000年我国肺癌标化发病率,男性为38.46/10万,而女性为15.7/10万,列恶性肿瘤年发病率的第一和第二位。
2000年我国肺癌死亡率,男性为33.21/10万,女性为13.45/10万。
平均5年生存率为14%。
肺癌根据其病理类型一般分为两大类,即非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。
NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌,它们占到全部肺癌的80%~85%,其具体的分型并不影响治疗的选择。
SCLC占全部肺癌的15%~20%,临床上亦称作燕麦细胞癌、小细胞未分化癌和低分化神经内分泌癌。
肺癌的治疗和预后在很大程度上取决于肺癌的细胞分型和分期。
因此,NSE的检测可用于SCLC的筛选检查、诊断、治疗中的监测和预后的评价。
本公司研制的NSE-TRIFMA采用双抗体夹心一步法。
鼠抗人NSE单抗包被于96孔板,校准品或样品中的NSE与包被单抗及铕离子(Eu3+)标记的单抗于微孔内表面发生免疫反应,微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记单抗通过洗涤分离。
微孔表面免疫复合物中的Eu3+被荧光增强液解离后形成稳定的荧光配合物,荧光强度与校准品或样品中的NSE浓度呈正比例,通过剂量-反应曲线可得出样品中NSE浓度。
铕标记螯合物采用中国医科院放射医学研究所制备的Eu-DTTA,经HPLC、红外、紫外分析,纯度较高(96%以上),各功能团符合分子结构。
选用两株配对优良的单克隆抗体,包被抗体以5μg/ml浓度包被,Eu-DTTA与标记抗体按1mg:
5mg标记,铕标记物的使用浓度为400ng/ml,增强液的主要成份β-NTA浓度为4μg/ml。
20-25℃条件下反应60分钟。
校准品、质控品均由高纯度抗原配制而成,浓度经过进口试剂校正。
对三批NSE定量检测试剂盒(TRIFMA法)进行检测表明:
最低检出量不高于0.7ng/ml;变异系数分析内CV<15%,分析间CV<20%;对NSE校准品进行测定,三个批号剂量-响应曲线的线性系数r值均>0.9900;与高浓度AFP、CEA、CA125交叉反应极低;以NSE企业标准品为对照品,试剂盒校准品的实测效价与标示效价的比值在0.900~1.100范围内。
与罗氏公司NSE定量检测试剂盒对168份血样测量值进行比校,相关系数为0.9753。
稳定性实验表明,三批NSE定量检测试剂盒于2-8℃放置0、6、12个月和37℃保存0、7、9天,NSE校准品荧光强度相对稳定,所有指标均符合2-8℃标准,说明NSE定量检测试剂盒(TRIFMA法)在一年有效期内保持稳定。
2、原理
以铕离子(Eu3+)标记抗NSE单克隆抗体,用另一株与之配对的单克隆抗体包被微孔。
标准或样品中的NSE于微孔内与固相单克隆抗体和铕离子标记单克隆抗体发生免疫反应。
洗涤分离后,固相表面的免疫复合物中的Eu3+浓度通过解离-荧光增强方式进行测量,荧光强度与血清NSE浓度成正相关。
检测原理示于下图:
NSETRIFMA分析原理
3、材料与方法
3.1主要仪器设备
3.1.1ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪(本公司)
3.1.2洗板机(本公司)
3.1.3震荡仪(本公司)
3.1.437℃孵箱上海跃进医疗器械厂
3.1.5HPLC(日本岛津公司)
3.2.主要原材料
3.2.1.专用原材料
抗NSE单克隆抗体购于北京中检维康公司。
NSE抗原购于北京中检维康公司。
Eu-DTTA:
N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠,分子量:
653.43,分子式:
C20H22N4O8SEuNa(每一分子连接一个铕离子),含量:
96%以上(HPLC分析),中国医学科学院放射医学研究所制备;BSA,上海生工生物工程公司。
微孔反应条(8×12):
CV(%)应<10%,深圳金灿华公司。
3.2.2.化学原料
Tris(三羟甲基氨基甲烷)进口/国产
盐酸G.R上海化学试剂公司
鸡冠花红A.R上海三爱思试剂有限公司
叠氮钠G.R上海生工生物工程有限公司
牛γ-球蛋白SIGMA
Tween20上海生工生物工程有限公司
BSA进口/上海普龙生物技术研发有限公司
无水碳酸钠A.R上海虹光化工厂
碳酸氢钠A.R上海虹光化工厂
氯化钠G.R上海化学试剂公司
醋酸钠A.R上海三浦化工有限公司
醋酸A.R上海化学试剂公司
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)A.R上海化学试剂公司
3.2.3实验用标准品与标本
3.2.3.1企业标准品:
自制,RocheNSEECLIA校正其浓度。
3.2.3.2NSE校准品:
用缓冲液将NSE抗原浓缩液稀释至一系列浓度梯度,用企业标准品校正。
4.实验方法
4.1原料制备\分析
4.1.1Eu-DTTA纯度分析与鉴定
4.1.1.1紫外分析(UV)测试条件:
溶剂为水,波长280nm
4.1.1.2红外分析(IR)
4.1.1.3HPLC分析波长:
254nm,溶剂30﹪甲醇。
4.1.2铕标记抗NSE单克隆抗体(McAb-Eu)制备
4.1.2.1铕标记物
1mgEu-DTTA用200ulpH9.60.05M碳酸缓冲液溶解。
加入抗NSEMcAb5mg,充分混匀,室温静置约36小时。
4.1.2.2纯化
取铕标记物过SephadexG50(上10cm)-Sepharose6B(下30cm)层析柱。
用0.05MpH7.8Tris-HCl缓冲液洗脱,收集蛋白峰各管合并。
4.1.2.3保存
铕标记物加入0.1-1%BSA,混匀置2-8℃保存。
4.2NSETRIFMA试剂盒各组分制备
4.2.1抗-NSE包被反应板的制备
1).包被液的配制
a).配制0.05MpH9.6碳酸缓冲液(碳酸钠1.6g,碳酸氢钠2.9g,去离子水至1000ml)。
b).将抗NSEMcAb按终浓度约5ug/ml加至0.05MpH9.6碳酸缓冲液中,混匀。
2).封闭液的配制
Tris6.06g,HCl3.0ml,NaCl9g,NaN30.5g,BSA10g,去离子水至1000ml。
3).包被抗-NSE
a)取微孔反应板每孔加入包被液100ul,室温~24小时。
b)洗涤:
以包被机或洗板机吸干包被液,注入洗涤液350ul/孔,立即吸干,重复2次。
c)封闭:
注入封闭液150ul/孔,室温~12小时。
d)甩干:
甩干封闭液,将板子放入甩干机甩干5分钟。
e)冻干:
打开冻干机,打开冷凝器制冷,使箱体内温度保持在-45℃以下,将板子放入机箱,打开蝶阀,然后打开真空泵,保温3h,停机,出板。
e)反应板包装:
将冻干后反应板装入锡铂袋并热封置2-8℃保存。
4.2.2铕标记物溶液的制备
取一定量的抗NSEMcAb-Eu,加铕标记稀释液至最终工作浓度的20倍,分装,加盖封口,2-8℃保存。
4.2.3NSE校准品的制备
用缓冲液将NSE浓缩液稀释成A、B、C、D、E、F六个标准点(浓度分别约0、1、5、20、100、500ng/ml),分装,冷冻干燥,以企业标准品校正。
于2~8℃保存。
4.2.4增强液的制备
无水乙醇 1ml
β-NTA 4mg
TOPO 20mg
冰醋酸 6ml
邻苯二甲酸氢钾 14g
Triton-x100 1ml
三蒸水至 1000ml
4.2.5浓缩洗液的制备
Tris600g
NaCl450g
Tween-2010ml
NaN325g
三蒸水至 2000ml
4.2.6铕标记保存液的制备
Tris6.06g
BSA3g
NaCl9g
NaN30.5g
去离子水至1000mL
充分混匀后,用HCl调整pH至7.8,稀释抗NSEMcAb-Eu;分装,2-8℃保存。
4.2.7分析缓冲液的配制
Tris6.06g
BSA20g
NaCl9g
Tween-201ml
EDTA-Na214.88mg
小鼠血清1.5ml
牛IgG0.5g
NaN31.0g
鸡冠花红0.05g
去离子水至1000mL
充分混匀后,用HCl调整pH至7.8,分装,2-8℃保存。
5、NSETRIFMA试剂盒操作步骤
5.1试剂的准备
5.1.1洗涤液:
将40ml浓缩洗液和960ml去离子水在干净的洗液瓶中混合,作为工作洗涤液备用。
5.1.2校准品:
在校准品各点中分别加入0.5ml去离子水,静置10分钟,混匀后使用。
5.1.3铕标记:
使用前一小时内,用分析缓冲液按1:
20稀释铕标记物。
5.2.操作步骤
5.2.1将试剂盒内分析缓冲液、校准品、所需数量的微孔反应条和待测样品平衡至室温(20~25℃)。
5.2.2吸取25μl的校准品和样品,按顺序加入相应微孔。
5.2.3在各微孔内加入100μl已稀释的铕标记溶液,在室温下于慢档振动60分钟。
5.2.4洗板6次,将板条在洁净的吸水纸上拍干。
5.2.5在每个微孔内加入100μl的增强液,于慢档振动5分钟。
5.2.6用时间分辨荧光测定仪检测。
5.3.结果判断
5.3.1结果测定:
用本公司ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪或WALLAC公司的各型时间分辨荧光检测仪测量时,检查程序的参数是否如下所示。
如不符,请修改。
ASSAYTYPE(分析类型):
IFMA(时间分辨免疫荧光分析法)
FITTINGMETHOD(曲线拟和方式):
SPLINESMOOTHED(平滑样条函数)
X-AXIS(X轴):
LOG
Y-AXIS(Y轴):
LOG-B
BLANKS(背景孔数):
2
STANDARDS(校准品):
5
STANDARDSREPLICATES(校准品复孔数):
2
STANDARDCONC(校准品浓度):
B
STANDARDCONC(校准品浓度):
C
STANDARDCONC(校准品浓度):
D
STANDARDCONC(校准品浓度):
E
STANDARDCONC(校准品浓度):
F
UNKNOWNREPLICATES(待测样品孔数):
1
5.3.2质量控制:
校准品A点荧光强度不高于5000,F点荧光强度不低于1200000。
否则重新实验。
6、NSETRIFMA试剂盒生产工艺的确定
6.1NSE包被浓度的选择
6.1.1抗NSE-McAb按最终浓度为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml进行包被,测量各校准点的荧光强度。
6.1.2铕标记物使用浓度为400ng/ml。
6.2铕标记条件和使用浓度的确定
6.2.1Eu-DTTA与抗NSE配比的选择
6.2.2.1Eu-DTTA与抗NSE配比为:
1mg:
2mg、1mg:
5mg、1mg:
10mg,按4.1.2标记、分离McAb-Eu。
6.2.2.2使用上述不同配比的McAb-Eu,按操作步骤制作NSETRIFMA校准曲线和测定质控品浓度值。
6.2.2.3抗NSE包被浓度为5ug/ml。
6.2.2抗NSEMcAb-Eu工作浓度的选择
6.2.2.1将抗NSEMcAb-Eu配制成200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml,按操作步骤制作NSETRIFMA校准曲线。
6.2.2.2抗NSE包被浓度为5ug/ml。
6.3反应时间的确定
选择室温和不同的反应时间,按操作步骤制作NSETRIFMA标准曲线,并测量低、中、高三种质控品的浓度。
6.4临界值的确定
用构建的试剂盒测定504份经RocheNSEECLIA确诊为阴性的NSE标本,以百分位数法确定试剂盒临界值。
7、NSETRIFMA诊断试剂盒质量评估
7.1NSETRIFMA标准曲线
按试剂盒使用说明书操作,分别以NSE浓度Log值、荧光强度Log值为横坐标和纵坐标作图,制作NSETRIFMA标准曲线。
7.2NSETRIFMA分析灵敏度
NSETRIFMA分析灵敏度规定为:
平行测定12次零标准的荧光计数SD的二倍在标准曲线上的对应值。
7.3NSETRIFMA精密性
对NSE质控血清分别于实验内和实验间作测定,分别计算实验内与实验间CV。
7.4质控品符合率
对NSE质控血清进行检测,质控血清测量值应在允许的范围内。
7.5相关性比较
以本方法对168例有Roche测量值的血清标本进行测量,考察本方法测量值与RocheNSEECLIA试剂盒测量值之间的相关性。
7.6交叉反应
用NSE-TRIFMA试剂盒检测高浓度AFP、CEA、CA125,计算交叉反应。
7.7稳定性试验
7.7.12-8℃稳定性:
将3个批号的NSE-TRIFMA试剂盒在2-8℃保存,第6、12个月检测一次。
7.7.237℃稳定性:
对3个批号的NSE-TRIFMA试剂盒进行37℃的稳定性实验,在7天、9天分别进行检测。
8、实验结果与分析
8.1Eu-DTTA纯度分析与鉴定
对Eu-DTTA(中国医科院放射医学研究所制备)的纯度分析与鉴定如下:
a)紫外分析(UV)图谱
图2Eu-DTTA的紫外分析(UV)图
b)红外分析(IR)图谱
图3Eu-DTTA的红外分析(IR)图
c)HPLC纯度分析
图4Eu-DTTA的HPLC纯度分析图
由HPLC图谱可见,中国医学科学院放射医学研究所制备的Eu-DTTA纯度不低于96%。
红外图谱(IR):
3487伯胺(NH2)弯曲振动,尖锐强峰
2012C≡N伸缩振动,强度较弱
1601C=O伸缩振动
1407、1502苯环骨架振动
紫外图谱(UV):
能测到268nm-280nm的位移
可见Eu-DTTA纯度较高,各功能团符合分子结构。
8.2试剂盒生产工艺确定
8.2.1抗NSE-McAb包被浓度的选择
固定铕标记物(抗NSEMcAb-Eu)终浓度为400ng/ml,以抗NSEMcAb浓度分别为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml包被微孔,测量各校准点的荧光强度。
表1.抗-NSE单抗包被浓度对校准品荧光强度的影响
包被浓度(μg/ml)
校准品荧光强度(CPS)
0ng/ml
1.45ng/ml
4.5ng/ml
17ng/ml
105ng/ml
470ng/ml
2.5
1173
4658
15330
58692
429599
1712752
5.0
1828
8207
24899
105295
676538
3234735
10.0
2441
10649
32653
133204
882662
3786789
表2.抗-NSE单抗包被浓度对信噪比的影响
包被浓度(μg/ml)
校准品荧光强度(CPS)
1.45ng/ml
4.5ng/ml
17ng/ml
105ng/ml
470ng/ml
2.5
3.97
13.07
50.03
366.22
1460.09
5.0
4.49
13.62
57.60
370.08
1769.47
10.0
4.36
13.38
54.58
361.65
1551.55
结果显示:
包被浓度为5μg/ml、10μg/ml时,公司NSE各校准点有较高的信噪比,分析灵敏度较高,且在校准品浓度范围内荧光强度线性良好,但当抗体浓度达5μg/ml时已基本达到饱和,10μg/ml包被浓度较高,原料用量较大,特异荧光强度增高有限,所以选择5μg/ml作为包被浓度。
8.2.2Eu-DTTA与标记用抗-NSE单抗最佳标记浓度选择
①包被用抗-NSE单抗按最终浓度为5.0μg/ml作为包被。
②室温下反应60min。
③Eu-DTTA与抗-NSE单抗标记浓度比:
1mg:
2mg、1mg:
5mg、1mg:
10mg三种。
④将以上三种标记条件的Eu-DTTA-抗-NSE,配制成200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml三种浓度,检测公司线性校准品的荧光强度。
结果见表3,4。
表3.Eu-DTTA与抗-NSE单抗用量比与使用浓度选择
Eu-DTTA:
5A6
浓度ng/ml
校准品荧光强度(CPS)
0ng/ml
1.45ng/ml
4.5ng/ml
17ng/ml
105ng/ml
470ng/ml
1:
2mg
200
1668
6612
20137
81960
546920
2421877
400
2627
11325
36627
142954
962901
4006527
800
3916
13467
42943
177964
1247656
4480997
1:
5mg
200
1274
4625
13667
56954
378289
1747196
400
1920
8349
25169
102497
694231
3035458
800
2749
10231
34488
141144
924518
3812423
1:
10mg
200
1418
2439
8165
28892
202640
966226
400
2002
4503
13927
54585
367139
1738833
800
2546
7946
24961
106103
669881
2906196
表4Eu-DTTA与抗-NSE单抗用量比与使用浓度对信噪比的影响
Eu-DTTA:
5A6
浓度ng/ml
校准品荧光强度(CPS)/A点荧光强度(CPS)
1.45ng/ml
4.5ng/ml
17ng/ml
105ng/ml
470ng/ml
1:
2mg
200
3.96
12.08
49.15
327.96
1452.26
400
4.31
13.94
54.41
366.48
1524.89
800
3.44
10.97
45.44
318.58
1144.18
1:
5mg
200
3.63
10.73
44.71
296.98
1371.66
400
4.35
13.11
53.38
361.56
1580.90
800
3.72
12.55
51.35
336.35
1387.02
1:
10mg
200
1.72
5.76
20.37
142.89
681.32
400
2.25
6.96
27.26
183.35
868.37
800
3.12
9.80
41.67
263.10
1141.44
结果表明:
当Eu-DTTA与9602按1mg/5mg标记,配制成400ng/ml工作浓度时,信噪比最佳,而且校准曲线范围内线性良好,表明Eu-DTTA与抗-NSE单抗按1:
5(W/W)标记,工作浓度为400ng/ml时,可得到良好的剂量-反应曲线。
8.2.3反应时间的选择
①包被用抗-NSE单抗按最终浓度为5.0μg/ml作为包被。
②铕标记物工作浓度为400ng/ml。
③一步法反应0.5小时、1小时和2小时分别检测公司NSE校准品和NSE公司质控血清。
④结果见表9。
表9反应时间的比较
NSE校准品
校准品浓度(ng/ml)
0
1.45
4.5
17
105
470
一步法0.5h
校准品荧光强度(CPS)
1268
5455
16450
62310
419300
1967603
NSE公司质控血清测量值(ng/ml)
7.68
23.49
85.93
一步法1h
校准品荧光强度(CPS)
1988
8046
25562
105895
695242
3130074
NSE公司质控血清测量值(ng/ml)
7.75
24.36
85.58
一步法2h
校准品荧光强度(CPS)
2162
8863
27111
108653
728168
3395885
NSE公司质控血清测量值(ng/ml)
7.80
23.17
86.70
由表9可以看出:
1小时和2小时对校准品的荧光强度没有明显影响,对公司质控血清的测量值也比较一致。
反应时间0.5小时的荧光强度偏低很多,不利于低浓度NSE的检测。
因此,本工作选用一步法反应1小时。
8.2.4临界值的确定
8.2.4.1标本:
所有标本均从医院收集,经过ROCHENSECLIA试剂盒检测,确认为阴性。
8.2.4.2用本公司NSE定量检测试剂盒测定504份正常人体检标本的NSE浓度以确定试剂盒正常范围。
8.2.4.2.1统计数据表1:
表1统计数据
检测浓度值(ng/ml)
标本个数
0.00-1.00
0
1.01-2.00
1
2.01-3.00
3
3.01-4.00
18
4.01-5.00
53
5.01-6.00
84
6.01-7.00
95
7.01-8.00
76
8.01-9.00
52
9.01-10.00
33
10.01-11.00
31
11.01-12.00
23
12.01-13.00
12
13.01-14.00
11
14.01-15.00
8
15.01-16.00
3
16.00-17.00
1
8.2.4.2.2对上述数据作图,见图1:
图1数据频率分布图
由图1可见,数据基本呈偏态分布。
8.2.4.2.3统计数据见表2:
表2统计数据
检测浓度值
频率(%)
累计频数
累计频率(%)
0.00-1.00
0.00
0
0.00
1.01-2.00
0.20
1
0.20
2.01-3.00
0.60
4
0.79
3.01-4.00
3.57
22
4.37
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