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基因芯片基因芯片技术知识概要的论文

[基因芯片]基因芯片技术知识概要的论文

　　生物科学正迅速地演变为一门信息科学。

最明显的一个例子就是目前正在进行的hgp（humangenomeproject），最终要搞清人类全部基因组的30亿左右碱基对的序列。

除了人的遗传信息以外，还有其它生物尤其是模式生物（modelorganism）已经或正在被大规模测序，如大肠杆菌、啤酒酵母、秀丽隐杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计划。

但单纯知晓生物基因组序列一级结构还远远不够，还必须了解其中基因是怎样组织起来的，每个基因的功能是什么，又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中展开其表达谱的，即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。

随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学）[1]，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-d-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物芯片（biochip）技术[2]。

　　一．什么是基因芯片

　　生物芯片，简单地说就是在一块指甲大小（1cm3）的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。

作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等）将生物分子探针（寡核苷酸片段或基因片段）以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子（如基因）相互作用，交行反应的固相表面，在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征，ccd相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号，作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。

生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。

而基因芯片中，最成功的是dna芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cdna在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交[3]的芯片。

　　基因芯片的基本原理同芯片技术中杂交测序（sequencingbyhybridization,sbh）。

即任何线状的单链dna或rna序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。

例如可把寡核苷酸序列ttagctcatatg分解成5个8nt亚序列：

（1）　　ctcatatg

（2）　　gctcatat

　　（3）　　agctcata

　　（4）　　tagctcat

　　（5）　　ttagctca

　　这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。

亚序列中a、t、c、g4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。

假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶dna杂交。

可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记dna/rna序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶dna杂交的寡核苷酸，从而推出靶dna中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶dna的互补寡核苷酸序列。

　　一般基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类[4]

（一）元件型微阵列芯片

　　1.生物电子芯片

　　2.凝胶元件微阵列芯片

　　3.药物控释芯片

（二）通道型微阵列芯片

　　1.毛细管电泳芯片

　　2.pcr扩增芯片

　　3.集成dna分析芯片

　　4.毛细管电层析芯片

　　（三）生物传感芯片

　　1光学纤维阵列芯片

　　2白光干涉谱传感芯片

　　小鼠基因表达谱芯片（mgec）

　　附:

目前国内基因芯片常见品种.（上海博星公司）

　　三基因芯片的制备

　　芯片种类较多，制备方法也不尽相同，常见的芯片可分为两大类：

一类是原位合成；一种是直接点样。

原位合成适用于寡核苷酸；直接点样多用于大片段dna，有时也用于寡核苷酸，甚至mrna。

原位合成有两种途径。

一是光蚀刻法；一是喷印法。

光蚀刻法可以合成30nt左右，喷印法可以合成40-50nt，光蚀刻法每步缩合率较低，一般为95%左右，合成30nt产率仅20%；喷印法可达99%以上，合成30nt产率可达74%，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。

此外，喷印法不需特殊的合成试剂。

与原位合成法比较点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cdna等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。

　　1、原位光蚀刻合成[5-7]　寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基。

合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5’端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。

使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。

某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。

例如：

一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。

　　目前美国affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的dna芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。

该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元，目前产品尚未公开投放市场发挥经济效益，但已有许多公司及研究机构与其签约购买其产品。

该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。

affymetrix的大部分产品将在98年底全面投放市场。

届时，在其产品被广泛采用的同时，其所有的研究投入将变成巨大的利润。

其它公司产品也正在从实验室技术研究走向开发应用。

目前，用于分子诊断的dna芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（cf）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。

鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：

⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率；⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。

　　另一方法是光导原位合成法。

具体方法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。

然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而n个核苷酸长的芯片需要4n个步骤。

每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4n个“feature”，包含了全部长度为n的核苷酸序列。

这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和pcr产物，但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。

运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探针间隔为5－10μm，但只能制作ii型dna芯片。

见图一。

　　2　原位喷印合成　芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。

喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。

该技术采用的化学原理与传统的dna固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。

　　3　点样法　点样法是将合成好的探针、cnda或基因组dna通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。

点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。

一些研究者采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的dna芯片可置于缓冲液中保存。

由于方法费时费力，不适于大规模dna芯片制作，因而实现自动化点样就显得尤为重要。

有的研究者用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。

大规模cdna芯片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。

dna芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类pcr产物。

有的研究者将玻片上覆盖20μm厚薄层聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用机械刻写或光刻的方法在其表面划上网格，并用激光照射蒸发掉单元间隙的多余凝胶，以实现dna芯片分区，单元大小为40×40μm或100×100μm间隔分别为50μm和100μm。

然后将化学方法合成的寡核苷酸探针自动化点样于各个单元内而制成dna芯片，点样速度可达2000单元/秒。

　　其装置采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印针的打印/喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。

根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。

打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。

直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。

打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针。

缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。

喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。

缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常1平方厘米只有400点。

国外有多家实验室和公司研究开发打印/喷印设备，目前有一些已经商品化。

军事医学科学院和益生堂生物企业公司目前正在联手利用打印/喷印技术进行生物芯片的研究和开发，预计2年内将有用于实验室研究或临床诊断的基因芯片产品问世。

见图二。

　　4　电子芯片[8-10]　电子芯片是由美国ｎanogen公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。

这种芯片为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化，制成1mm×1mm的阵列、每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。

将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。

电子芯片最大特点是杂交速度快，可大大缩短分析时间。

制备复杂、成本高是其不足。

　　5　三维芯片[11-12]　三维芯片是由美国的packard、摩托罗拉、argonne国家实验室三家机构与俄罗斯engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。

三维生物芯片实质上是一块显微镜载玻片，其上有10,000个微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶dna，rna和蛋白质的分析。

先把乙知化合物加在凝胶条上，再用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。

每个毛细管能把小到的体积打到凝胶上。

以上几家机构合作研究的生物芯片系统具有其它生物芯片系统不具有的几个优点。

一是凝胶的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。

二是可以在芯片上同时进行扩增与检则。

一般情况下，必须在微量多孔板上先进行pcr扩增，再把样品加到芯片上，因此需要进行许多额外操作。

本芯片所用凝胶体积很小。

使pcr扩增体系的体积减小1,000倍（总体积约纳升级），从而节约了每个反应所用的pcr酶（约减少100倍）。

三是以三维构象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然状态在凝胶条上分析，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。

　　6　流过式芯片（flow-thruchip）[13]　cenelogic正在开发一种在芯片片基上制成格栅状微通道，cenelogic设计及合成特定的寡核苷酸探针，结合于微通道内芯片的特定区域。

从待测样品中分离dna或rna并对其进行荧光标记，然后，该样品流过芯片，固定的寡核苷酸探针捕获与之相互补的核酸，采用cenelogic’s信号检测系统分析结果。

流通式芯片用于高通量分析已知基因的变化，其特定在于⑴敏感性高：

由于寡核苷酸吸附表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化；⑵速度快：

微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间；⑶价格降低：

由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸附于微通道内，使每一种流过芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。

　　四．基因芯片样品制备

　　一般说来应用dna芯片进行实验包括5个过程：

生物学问题的提出和芯片设计；样品制备；生物杂交反应；结果探测；数据处理和建模。

　　1．样品制备。

一般所需mrna的量是以一张表达谱芯片需要3μgmrna计算的

　　考虑到个体差异以及样品在研磨、匀浆等过程中的损失，客户提供的样品量应在上述基础上增加1-2倍。

　　2样本采集过程关键点．

　　组织标本采集操作建议规程,（取标本所需关键器材和处理要求）

　　注：

　　·以下步骤1－5应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的rna降解。

　　·对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。

　　1离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。

胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。

　　2在rnase-free％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。

　　3用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织（但最好统一采用铝箔）。

用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。

　　4填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等

　　将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：

样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐

　　5保留1-2张取材部位的病理切片。

　　五.生物芯片杂交

　　待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。

根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。

当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。

高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。

为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、pcr、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。

用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。

　　杂交条件的选择与研究目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。

通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。

如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。

表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。

突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。

　　此外，杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针gc含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。

有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍[9]。

连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。

由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此有人提出用不带电荷的肽核酸（pna）做探针[9]。

虽然pna的制备比较复杂，但与dna探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。

由于pna-dna结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。

　　六基因芯片检测原理

　　杂交信号的检测是dna芯片技术中的重要组成部分。

以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法，如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射表面共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等等，但并非每种方法都适用于dna芯片。

由于dna芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模dna芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机（charged-coupleddevicecamera，ccd）摄像机等弱光信号探测装置。

此外，大多数dna芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。

杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。

　　由于所使用的标记物不同，因而相应的探测方法也各具特色。

大多数研究者使用荧光标记物，也有一些研究者使用生物素标记，联合抗生物素结合物检测dna化学发光。

通过检测标记信号来确定dna芯片杂交谱型。

　　1．荧光标记杂交信号的检测方法

　　使用荧光标记物的研究者最多，因而相应的探测方法也就最多、最成熟。

由于荧光显微镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物，并具有很好的空间分辨率和热分辨率，特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时，分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率，而在传统的显微镜是很难做到的，这便为dna芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的基础。

大多数方法都是在人射照明式荧光显微镜（epifluoescencemicroscope）基础上发展起来的，包括激光扫描荧光显微镜、激光共焦扫描显微镜、使用了ccd相机的改进的荧光显微镜以及将dna芯片直接制作在光纤维束切面上并结合荧光显微镜的光纤传感器微阵列。

这些方法基本上都是将待杂交对象以荧光物质标记，如荧光素或丽丝胶（lissamine）等，杂交后经过ssc和sds的混合溶液或sspe等缓冲液清洗。

（1）激光扫描荧光显微镜

　　探测装置比较典型。

方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5－10μm。

同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。

通过计算机控制传动平台x－y方向上步进平移，dna芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。

这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的dna芯片及大规模dna芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。

（2）激光扫描共焦显微镜

　　激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。

这种方法可以在荧光标记分子与dna芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。

affymetrix公司的s．p．a．forder等人设计的dna芯片即利用此方法。

其方法是将靶dna分子溶液放在样品地中，芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下，与样品池溶液直接接触，并与dna样品杂交。

当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时，既有芯片上杂交的dna样品所发出的荧光，也有样品地中dna所发出的荧光，如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。

而共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率，可以在接受芯片表面荧光信号的同时，避开样品池中荧光信号的影响。

一般采用氩离子激光器（488nm）作为激发光源，经物镜聚焦，从芯片背面入射，聚集于芯片与靶分子溶液接触面。

杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集，并经滤波片滤波，被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。

经模数转换反转换为数字信号送微机处理，成像分析。

在光电信增管前放置一共焦小孔，用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号，避免其对探测结果的影响。

激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径，使之能够只照射在单个探针上。

通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。

其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。

现在affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约12万美元。

　　（3）采用了ccd相机的荧光显微镜

　　这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以ccd相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。

由于不是逐点激发探测，因而激发光照射光场为整个芯片区域，由ccd相机获得整个dna芯片的杂交谱型。

这种方法一般不采用激光器作为激发光源，由于激光束光强的高斯分布，会使得光场光强度分布不均，而荧光信号的强度与激发光的强度密切相关，因而不利于信号采集的线性响应。

为保证激发光匀场照射，有的学者使用高压汞灯经滤波片滤波，通过传统的光学物镜将激发光投射到芯片上，照明面积可通过更换物镜来调整；也有的研究者使用大功率弧形探照灯作为光源，使用光纤维束与透镜结合传输激发光，并与芯片表面呈50o角入射。

由于采用了ccd相机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。

其特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用[14].

　　（4）光纤传感器

　　有的研究者将dna芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。

光纤维束由7根单模光纤组成。

每根光纤的直径为200μm，两端均经化学方法抛光清洁。

化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。

将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（490urn），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由ccd相机接收。

每根光纤单独作用互不干扰，而溶液中的荧光信号基本不会传播到光纤中，杂交到光纤远端的靶分子可在90％的甲酸胺（formamide）和te缓冲液中浸泡10秒钟去除，进而反复使用。

这种方法快速、便捷，可实时检测dna微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模dna芯片，有一定的应用局限性。

　　2.生物素标记方法中的杂交信号探测

　　以生物素（biotin）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。

特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于dna芯片杂交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。

因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。

　　目前应用较多的是美国generalscanning公司开发的基因芯片专用检测系统（scanarray3000），采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。

近期又开发出了scanarray5000，其扫描精度和功能有较大的提高。

　　七结果的分析

　　样品在被测定前，首先要经过消化，使待测组织细胞中的dna或rna释放出来，在经过适当的扩增后，以荧光标记物标记，放入基因芯片自动孵育装置（fluidicsstation）中，由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件，进行杂交，这一过程，仅需要数秒钟。

杂交完成后，要对基因芯片进行“读片”，即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜，对基因芯片表面的每个位点进行检测。

这种显微镜，将聚焦的平面设定