第五章酶工程doc.docx
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第五章酶工程doc
第五章酶工程技术
【典型案例】
图1啤酒生产线图2石油泄漏污染海湾
案例1:
酶制剂在啤酒生产中的应用
酶制剂在啤酒生产中的应用较为广泛,酶制剂的使用,能降低啤酒生产成本,在液化、糖化、啤酒澄清、防腐以及防止老化过程中应用效果明显。
辅料淀粉的液化一般选用a-淀粉酶,a-淀粉酶可将淀粉液化成可溶于水的糊精、低聚糖、麦芽糖以及葡萄糖。
糖化过程中,辅料的糊化醪(液化)和麦芽中淀粉受到麦芽中水解酶及外加酶制剂作用,形成以麦芽糖为主的可发酵性糖。
这一过程添加的酶有:
β-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、半纤维素酶等。
啤酒在贮存过程中,由于环境条件的作用,如光照、氧气、震动等,会产生浑浊、沉淀等现象。
此类浑浊的形成,和啤酒中残留的蛋白质关系密切,严重影响啤酒的质量和在市场上的竞争力。
添加蛋白酶可分解啤酒中的大分子蛋白质,有效去除啤酒中的沉淀物,澄清过程中主要用到的酶有木瓜蛋白酶、、生姜蛋白酶和中性蛋白酶。
超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶可防止啤酒中风味老化物质的前提被氧自由基氧化而造成啤酒老化。
同时,为了啤酒防腐保鲜,可在啤酒生产的发酵期、包装过程中添加少量溶菌酶,溶菌酶可作用于革兰氏阳性菌细胞胞壁的N-乙酰胞壁酸与N-脱氢基葡萄糖之间β-1,4糖苷键,从而破坏细菌细胞壁,使细菌溶解死死亡,但对啤酒酵母不起作用。
案例2:
酶制剂在石油废水处理中的应用
石油是含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃、环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、酸类)的复杂混合物。
2013年底发生的黄岛石油管道爆炸事件导致胶州湾近1万平方米海域受到石油污染,每年因油轮失事、油田漏油、喷井等事故流入海洋的石油污染物约有1千万吨。
目前针对石油生物降解主要集中于具有较强降解能力的菌株的筛选上,然而这些微生物在海水中的繁殖受各种环境条件的影响,繁殖率很低。
石油烃降解酶的分离纯化不仅是石油降解工程菌构建的基础,还可直接用于石油的生物降解,提高石油生物降解的效率。
目前常用的石油烃降解酶包括甲烷单加氧酶、环羟基化双加氧酶、邻苯二酚双加氧酶、萘双加氧酶等。
以上是酶工程技术在食品生产技术和环境保护方面的二个案例。
通过广泛学习和调研,我们还可以了解更多的酶工程技术在我们日常生活中发挥的重要作用。
学习指南
本章主要介绍酶工程技术,希望通过本章的学习,读者可以了解酶工程技术的研究意义及发展现状;掌握酶与酶工程的概念和酶的生产技术、分离纯化技术;重点掌握酶在食品、医药、环保、轻工业等各个领域的应用技术。
第一节概述
一、酶的概念及酶的研究意义
酶是具有生物催化功能的生物大分子,按照其化学组成,可以分为蛋白质类酶(P酶)和核酸类酶(R酶)。
蛋白类酶主要由蛋白质组成,核酸类酶主要由核糖核酸(RNA)组成。
目前已发现的酶有7000种以上。
它们分布于细胞的不同细胞器中,催化细胞生长代谢过程中的各种生物化学反应。
在直径不足2µm的细菌细胞中,就有1000多种酶参与生物催化反应。
细胞生命代谢中的化学反应都是在酶的催化作用之下进行的。
没有酶的存在,生命就会停止。
酶与生物科学密切相关。
酶既是分子生物学研究的重要对象,又是研究生物学的重要工具。
酶作为基因的切割工具具有独到的作用,它能够用于基因分离与重组。
在基因工程研究中,多种工具酶相继发现,使得基因体外操作成为现实。
工具酶成为基因工程的三大重要支撑技术之一。
对酶的深入研究推动了多种学科的发展,产生了多个交叉新学科。
20世纪以来,先后形成了生物化学、生物技术、生物有机化学、生物无机化学、以及仿生学等。
其中生物技术占有核心地位,其研究与应用推动了工业、农业、食品环保、医药卫生甚至国防航天事业的快速发展,成为21世纪发展的主导学科之一。
酶工程作为生物技术的分支,在上述领域的发展中起到了十分重要的作用。
二、酶的研究简史
据资料记载,4000多年前的夏禹时代已经出现酿酒技术,酒是酵母发酵的产物,是酵母细胞内酶作用的结果。
公元10世纪,我国人民发明了通过霉菌发酵将豆类做成豆酱;3000年前使用麦曲制造饴糖和使用曲类治疗消化不良都是利用淀粉酶和水解酶的作用。
真正出现酶的概念是1878年。
当时德国的Kuhne将从麦芽中分离出来的一种能够水解淀粉的物质称为“Enzyme”,后来被翻译为“酶”。
1896年德国人Buchner兄弟发现酵母的破碎细胞分离液体与完整酵母一样具有将葡萄糖降解为乙醇和二氧化碳的作用,他们将该物质称为酒化酶。
因此比较公认的看法是,酶学的研究是从1896年Buchner兄弟的实验开始的。
20世纪初,酶学得到了迅速发展。
一是发现酶的种类越来越多,二是开展了对酶的作用机理研究,如酶反应的条件与反应机制等,同时发现了辅酶在酶催化反应中的重要意义。
MichaelisMenton于1913年提出了酶促反应动力学原理——米氏学说。
1926年,Summer从刀豆中得到脲酶结晶,经过反复实验证实,酶本身就是一种蛋白质。
在后来获得多种酶的结晶后人们接受了Summer的结论。
1947年Summer获得诺贝尔化学奖。
与此同时,运用X射线衍射分析,人们相继弄明确了溶菌酶、胰凝乳蛋白酶等多种酶的结构和作用机制。
20世纪中期,针对酶在反应中表现出来的相对专一性和绝对专一性,Koshland提出了“诱导契合”学说。
Monod提出了“变构模型”,解释了酶的调控机制。
1969年我国科学家首次人工合成具有生物活性的牛胰岛素,这一成就成为酶学研究的重要里程碑。
基因工程技术的诞生为酶的研究和发展带来了一次重要的机遇。
DNA定点突变技术可以改变酶的活性及专一性。
特别是酶活性中心的氨基酸残基的变化对酶的作用是十分显著的。
1982年,Cech等人发现核酸也具有生物催化功能。
“核酶”(ribozyme)概念的出现对于传统的“酶是具有催化功能的蛋白质”的表述是极大的挑战。
人们接受了核酸具有催化功能的事实,最终将酶定义为“酶是具有生物催化功能的生物大分子”。
现在酶的应用领域越来越广。
食品工业、医药卫生、轻纺化工、环保等领域都是酶的重点开发方向。
酶的应用改变了人们的生活。
如在日常生活中使用的加酶洗衣粉,同一般的洗衣粉相比,加酶洗衣粉中含有蛋白质和脂肪酶等多种酶,去除汗渍和油污的能力比传统的洗衣粉强了许多倍。
酶的应用同时促进了酶工程的发展。
三、酶工程技术
所谓酶工程,就是在一定的生物反应器中,利用酶的催化作用,将相应的原料转化成有用物质的技术。
而且酶工程在生物工程占极其重要的地位,没有酶的作用,任何生物工程技术都不能实现。
概括地说,酶工程包括酶制剂的生产和应用两个方面。
虽然已知酶的种类约7000多种,但实际已被运用于工业生产的仅10余种。
已经能够实现工业化生产的酶有淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶等,其中碱性蛋白酶用于加酶洗涤剂,占酶销售额的首位,青霉素固化酶用于医疗,占世界用量的第二位。
在初期酶制剂主要来源于动植物材料,今天酶的来源主要来自微生物。
生产酶制剂的过程包括酶的产生、提取、纯化和固定化等步骤。
1.酶的产生、提取和纯化
(1)酶的产生酶普遍存在于动物、植物和微生物体内。
人们最早是从植物的器官和组织中提取酶的。
例如,从胰脏中提取蛋白酶,从麦芽中提取淀粉酶;现在,酶大都来自微生物发酵生产,这是因为同植物和动物相比,微生物具有容易培养、繁殖速度快和便于大规模生产等优点。
只要提供必要的条件,就可以利用微生物发酵来生产酶。
(2)酶的提取和纯化从微生物、动植物细胞中得到含有多种酶的提取液后,为了从混合液中获得所需要的某一种酶,必须将提取液中的其他物质分离,以获得纯化酶的目的。
2.酶的固定化
酶固定化技术是先将纯化的酶连接到一定的载体上,使用时将被固定的酶投放到反应溶液中,催化反应结束后又能将被固定的酶回收。
固定化酶的技术是1969年日本首先研制成功,现在该方法已经应用到多种酶的生产中。
固定化酶一般是呈膜状、颗粒状或粉状的酶制剂,它在一定的空间范围内催化底物反应。
3.固定化细胞
利用胞内酶制作固定化酶时,先要把细胞打碎,才能将里面的酶提取出来,这就增加了酶制剂生产的工序和成本。
直接固定细胞同样可以提供我们所需的酶(胞内酶),因此固定化细胞同样可以代替酶进行催化反应。
例如,将酵母细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中,制成的固定化酵母细胞,可以用于酒类的发酵生产。
四、酶制剂的应用
目前随着酶工程技术的发展,酶已经广泛应用于医药卫生、食品加工、环境保护和轻化工业上。
如在医药上胰岛素作为治疗糖尿病的常用药品;尿激酶可以用来活化人体内的溶纤维蛋白酶原,使溶纤维蛋白酶原转化为溶纤维蛋白酶,溶化血栓,治疗脑溢血、心肌梗塞、肺动脉阻塞等心脑血管疾病。
在食品加工上,利用酶制剂生产产品,可以提高生产效率。
如酿酒厂和饮料厂利用果胶酶来澄清果酒和果汁;如用葡萄糖氧化酶可以除去密封饮料和罐头中的氧气,从而有效地防止饮料和食品氧化变质;再如,用木瓜蛋白酶制成的嫩肉粉,可以使肉丝、肉片等烹调后吃起来嫩滑可口等等。
在环境保护上,利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶传感器,快速测定出炼油和炼焦工厂排放到河流和湖泊水中的酚量。
在化学纺织工业等方面,应用蛋白酶,既加速皮革的浸水、脱毛、软化过程,改变旧工艺脏、累、臭的状况;在纺织方面,一些纺织原料也可以利用酶制剂进行加工;利用蛋白酶对天然蚕丝进行脱胶,脱胶后的蚕丝具有鲜亮的色泽和柔滑的手感。
酶的应用例子很多,将在后续的章节中重点介绍。
第二节酶的发酵生产
商业用酶来源于动植物组织和某些微生物。
传统上由植物组织提供的酶有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶和其他酶,由动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和凝乳酶。
但是,从动物组织或植物组织大量提取的酶,经常会涉及到技术、经济以及伦理上的问题,许多传统的酶源已远远不能适应当今世界对酶的需求。
为了扩大酶源,人们正越来越多地求助于微生物。
微生物作为酶生产的主要来源有以下原因。
①生物生长繁殖快,世代时间短,产量高。
②微生物培养方法简单,生产原料来源丰富,价格低廉,机械化程度高,经济效益高。
③微生物菌株种类繁多,酶的品种齐全。
④微生物有较强的适应性和应变能力,可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。
虽然如此,但能够用于酶工业化生产的微生物种类还是十分有限的。
主要是使用未经检验的微生物进行生产存在产品毒性与安全性问题。
基于这个原因,目前大多数工业微生物酶的生产,都局限于使用仅有的极少数的真菌或细菌。
其次,产酶菌株的筛选也有较严格的标准。
一、产酶优良菌种的筛选
1.优良菌株的标准
优良的产酶菌种是提高酶产量的关键,筛选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首要环节,一个优良的产酶菌种应具备以下特点:
(1)繁殖快、产量高、生产周期短。
(2)适宜生长的底物低廉易得。
(3)产酶性能稳定、不易退化、不易受噬菌体侵袭。
(4)产生的酶容易分离纯化。
(5)安全可靠,非致病菌,不会产生有毒物质。
2.筛选过程
产酶菌种的筛选方法主要包括以下几个步骤:
含菌样品的采集,菌种分离,产酶性能测定及复筛等。
对于产生胞外酶的菌株,经常采用分离、定性和半定量测定相结合的方法,在分离时就基本能够预测菌株的产酶性能。
胞外酶产酶菌株的筛选操作如下:
将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板,然后将待测菌涂布在培养基表面,如果菌落周围的底物浓度发生变化,即证明它产酶。
如果是产生胞内酶的菌株筛选,则可采用固体培养法或液体培养法来确定。
①固体培养法。
将菌种接入固体培养基中保温数天,用水或缓冲液将酶抽提,测定酶活力,这种方法主要适用于霉菌。
②液体培养法。
将菌种接入液体培养基后,静置或振荡培养一段时间(视菌种而异),再测定培养物中酶的活力,通过比较,筛选出产酶性能较高的菌种继续筛选。
3.产酶常用的微生物
按照产酶微生物的筛选标准,常用的产酶微生物有以下几类:
(1)细菌细菌是工业上有重要应用价值的原核微生物。
在酶的生产中,常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
大肠杆菌可以用于生产多种酶,如谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等;枯草芽孢杆菌可以生产α-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等。
(2)放线菌常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌。
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物,同时也可以生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
(3)霉菌霉菌是一类丝状真菌,用于酶生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等,生产的酶种类有糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核酸核糖酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、凝乳酶等20多种酶。
(4)酵母常用于产酶的酵母有啤酒酵母和假丝酵母。
啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产,此外,还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的生产;假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶等。
二、基因工程菌株(细胞)
基因工程技术可以将未经批准的产酶微生物的基因或由生长缓慢的动植物细胞产酶的基因,克隆到安全的、生长迅速的、产量很高的微生物体内,形成基因工程菌株,然后发酵生产。
基因工程技术还可以通过增加基因的拷贝数,来提高微生物产生的酶数量。
目前,世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司(Novozyme),生产酶制剂的菌种约有80%是基因工程菌。
至今已有100多种酶基因克隆成功,包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。
要构建一个具有良好产酶性能的基因工程菌株,必须具备良好的宿主-载体系统。
理想的宿主应具备以下几个特性:
1体与宿主相容,携带酶基因的载体能在宿主体内稳定维持;
②菌体容易大规模培养,生长无特殊要求,且能利用廉价的原料;
③所产生的目标酶占总蛋白量的比例较高,且能以活性形式分泌;
④宿主菌对人安全,不分泌毒素。
自然界蕴藏着巨大的微生物资源,在发现的微生物中,有99%的微生物是在实验室内使用常规的培养方法培养不出的微生物。
现在人们可以采用新的分子生物学方法直接从这类微生物中探索和寻找有开发价值的新的微生物菌种、基因和酶。
目前科学家们热衷于从极端环境条件下生长的微生物中筛选新的酶,主要研究嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、嗜硫微生物和嗜压微生物等。
这就为新酶种和酶的新功能开发提供了广阔的空间。
目前在嗜热微生物的研究方面取得了可喜的进展,例如耐高温的淀粉酶和DNA聚合酶等已得到广泛的应用。
三、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下,有目的地利用微生物培养来生产所需的酶,其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。
1.培养基
(1)碳源碳源是微生物细胞生命活动的基础,是合成酶的主要原料之一。
工业生产上应考虑原料的价格及来源,通常使用各种淀粉及它们的水解物如糊精、葡萄糖等作为碳源。
在微生物发酵中,为减少葡萄糖所引起的分解代谢物的阻遏作用,采用淀粉质材料或它们的不完全水解物比葡萄糖更有利。
一些特殊的产酶菌需要特殊的碳源才能产酶,如利用黄青霉生产葡萄糖氧化酶时,以甜菜糖蜜作碳源时不产生目的酶,而以蔗糖为碳源时产酶量显著提高。
(2)氮源氮源可分为有机氮和无机氮。
选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而不同,如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培养基,多数以豆饼粉、花生饼粉等为氮源,因为这些高分子有机氮对蛋白酶的形成有一定程度的诱导作用;而利用绿木霉生产纤维素酶时,应选用无机氮为氮源,因为有机氮会促进菌体的生长繁殖,对酶的合成不利。
(3)无机盐类有些金属离子是酶的组成成分,如钙离子是淀粉酶的成分之一,也是芽孢形成所必需的金属离子。
无机盐一般在低浓度情况下有利于酶产量的提高,而高浓度则容易产生抑制。
(4)生长因子生长因子是指细胞生长必需的微量有机物,如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等。
有些氨基酸还可以诱导或阻遏酶的合成,如在培养基中添加大豆的酒精抽提物,米曲霉的蛋白酶产量可提高约2倍。
(5)pH值在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH。
一般情况下,多数细菌、放线菌生长的最适pH为中性至微碱性,而霉菌、酵母则偏好微酸性。
培养基的pH不仅影响微生物的生长和产酶,而且对酶的分泌也有影响。
如用米曲霉生产α-淀粉酶,当培养基的pH由酸性向碱性偏移时,胞外酶的合成减少,而胞内酶的合成增多。
2.酶的发酵生产方式
酶的发酵生产方式有两种,一种是固体发酵,另一种是液体深层发酵。
固体发酵法用于真菌的酶生产,其中用米曲霉生产淀粉酶,以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久的历史。
这种培养方法虽然简单,但是操作条件不易控制。
随着微生物发酵工业的发展,现在大多数的酶是通过液体深层发酵培养生产的。
液体深层培养应注意控制以下条件:
(1)温度温度不仅影响微生物的繁殖,而且也显著影响酶和其他代谢产物的形成和分泌。
一般情况下产酶温度低于最适生长温度,例如酱油曲霉蛋白合成酶合成的最适温度为28℃,而其生长的最佳温度为40℃。
(2)通气和搅拌需氧菌的呼吸作用要消耗氧气,如果氧气供应不足,将影响微生物的生长发育和酶的产生。
为提高氧气的溶解度,应对培养液加以通气和搅拌。
但是通气和搅拌应适当,以能满足微生物对氧的需求为妥,过度通气对有些酶(如青霉素酰化酶)的生产会有明显的抑制作用,而且剧烈搅拌和通气容易引起酶蛋白变性失活。
(3)pH的控制在发酵过程中要密切注意控制培养基pH的变化。
有些微生物能同时产生几种酶,可以通过控制培养基的pH以影响各种酶之间的比例,例如当利用米曲霉生产蛋白酶时,提高pH有利于碱性蛋白酶的形成,降低pH则主要产生酸性蛋白酶。
3.提高酶产量的措施
在酶的发酵生产过程中,为了提高酶的产量,除了选育优良的产酶菌株外,还可以采用其他措施,例如添加诱导物、控制阻遏物浓度等。
(1)添加诱导物对于诱导酶的发酵生产,在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。
诱导物一般可分为三类:
①酶的作用底物,例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物;②酶的反应产物,例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生;③酶的底物类似物,例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。
而使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。
(2)降低阻遏物浓度微生物酶的生产会受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。
为避免分解代谢物的阻遏作用,可采用难于利用的碳源,或采用分批添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。
例如在β-半乳糖苷酶的生产中,只有在培养基中不含葡萄糖时,才能大量诱导产酶。
对于受末端产物阻遏的酶,可通过控制末端产物的浓度使阻遏解除。
例如,在组氨酸的合成途径中,10种酶的生物合成受到组氨酸的反馈阻遏,若在培养基中添加组氨酸类似物,如2-噻唑丙氨酸,可使这10种酶的产量增加10倍。
(3)表面活性剂在发酵生产中,非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂,但它的作用机制尚未明确;可能是由于它的作用改变了细胞的通透性,使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来,从而打破胞内酶合成的反馈平衡,提高了酶的产量。
此外,有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用,可以提高酶的活力,例如利用霉菌发酵生产纤维素酶,添加1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
(4)添加产酶促进剂产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质,它可能是酶的激活剂或稳定剂,也可能是产酶微生物的生长因子,或有害金属的螯合剂,例如添加植物钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的5ˊ-磷酸二酯酶的产量提高2-20倍。
第三节酶的提取与分离技术
酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来,再与杂质分离,而获得所需酶的过程。
主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
一、细胞破碎
除胞外酶外,绝大多数酶都存在于细胞内部。
为了获得细胞内的酶,首先要收集细胞、破碎细胞,让酶从细胞内释放出来,然后进行酶的提取和分离纯化。
细胞的破碎方法可以分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。
在实际应用时应当根据具体情况选择适宜的细胞破碎方法,有时也采用两种或者两种以上的方法联合使用,达到较好的破碎效果。
表5-1列出了几种细胞破碎方法及原理。
表5-1细胞破碎方法及原理
分类
细胞破碎方法
细胞破碎原理
机械破碎法
捣碎法
研磨法
匀浆法
通过机械运动产生的剪切力,是组织、细胞破碎
物理破碎法
温度差破碎法
压力差破碎法
超声波破碎法
通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结构破坏,从而使细胞破碎。
化学破碎法
添加有机溶剂
添加表面活性剂
通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而是细胞破碎
酶促破碎法
自溶法
外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,是细胞外层结构破坏,而使细胞破碎
二、酶的提取
酶的提取是指在一定条件下,用适当的溶液或溶剂处理含酶原料,使酶溶解到溶剂中来,实际上就是酶的抽提过程。
酶提取时,溶剂的选择与酶的结构和溶解性质有关。
一般来说,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶液中,碱性物质易溶于酸性溶液中。
根据酶的结构特点,绝大部分酶都能够溶于水中,通常可以采用稀酸、稀碱、稀盐溶液提取;有些酶与脂类物质结合或者带较多的非极性基团,则采用有机溶剂提取。
表5-2列出了提取酶的各种方法。
表5-2酶的主要提取方法
提取方法
用于提取的溶剂
提取的酶的性质
盐溶液提取
0.02-0.5mol/L的盐溶液
在低盐溶液中溶解度较大的酶
酸溶液提取
pH2-6的水溶液
在稀酸溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶
碱溶液提取
pH8-12的水溶液
在稀碱溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶
有机溶剂提取
可与水混溶的有机溶剂
与脂类结合或者含较多非极性基团的酶
为了提高酶的提取效率并防止酶变性失活,在提取过程中要注意控制温度、pH值等提取条件。
三、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质,使酶的溶解度降低,从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。
沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法等。
表5-3列出了各种沉淀法的分离原理。
表5-3沉淀分离方法
沉淀分离方法
分离原理
盐析沉淀法
利用酶(蛋白质)不同盐浓度下的溶解度不同的原理,使酶或者杂质析出沉淀,从而使酶与杂质分离
等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点的特性,调节溶液的pH值,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离
有机溶剂沉淀法
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的有机溶剂,使酶与杂质沉淀析出,使酶与杂质分离
复合沉淀法
在酶液中加入某些物质,使它与酶形成复合物而沉淀下来,从而使酶与杂质分离
四、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
根据离心机最大转速的不同,可以分为低速离心机、高速离心机和超速离心机三种。
低速离心机的最大转速在8000rpm。
在酶的分离纯化中,主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离,也可用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机的最大转速为(1-2.5)x104rpm。
在酶的分离纯化过程中,主要用于细胞碎片和细胞器的分离。
为防止高速离心时产生高温导致酶变性失活,配置冷冻降温装置,称为高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达到(2.5-12)x104rpm。
主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器和病毒的分离纯化;沉降系数和相对分子质量的测定等。
超速离心机的要求较高,均配置有冷冻系统、控温系统、真空系统、制动系统和安全系统等。
五、过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大
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