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人工细胞用于酶的固定
摘要
目前,酶在生物体外的应用已经涉及到化工、医学、食品等各种行业。
然而,由于游离酶不稳定,容易失活,限制了酶的应用,酶的固定化技术是解决这一问题的途径之一。
随着固定化酶的发展,多酶的固定化已经成为一个新的挑战。
本文结合生物仿生硅化,层层组装技术,模拟细胞核和细胞的关系,以具生物相容性的碳酸钙为模板,通过层层组装精蛋白和硅酸钠,制备出一种新型的的“壳中壳”载体,利用这种载体能够实现分区包埋两种不同的酶—葡糖糖氧化酶和辣根过氧化酶,能够避免两种酶之间的干扰,也可以减少中间代谢物的传质路径,提高反应速率。
载体制备过程温和,能够保持较高的酶活。
最后考察了将两种酶包埋在制备载体中的催化效果,发现这种包埋方法比混合包埋两种酶的反应速度要快约15-30%。
在重复使用6次后,仍能保持约65%的活力。
关键词:
多酶固定化;层层自组装;仿生硅化;人工细胞;葡萄糖氧化酶;辣根过氧化酶
ABSTRACT
Enzymehasbeenwidelyappliedinindustrialfieldssuchaschemicalengineering,food,biomedicalfields.However,freeenzymeisalwaysvulnerableandeasytodenatureanddifficulttoreuse,whichrestrictthepracticalapplicationofenzyme.Enzymeimmobilizationisoneoftheeffectivemethodstosolvethisproblem.
Asthedevelopingoftheenzymeimmobilizationtechnique,multienzymeimmobilizationtocarrycascadereactionsemerges.
Thisworkdemonstratesanovelwaytoencapsulatetwodifferentenzymesinonecapsuletocarryacascadereaction.Theseshell-in-shellstructureswerefabricatedbyalternativedepositionofpositivelychargedprotaminelayersandnegativelychargedsilicalayersonthesurfaceofCaCO3microparticles,followedbyacoprecipitationwithCaCO3,thenbydissolutionoftheCaCO3microparticlesusingEDTA.Themicrocapsulewasusedtoencapsulatetwodifferentenzyme-glucoseoxidaseandhorseradishperoxidaseinseparatedandconfinedzonesinthemicrocapsulelikecompartmentsinnaturalcells.Comparedtotheenzymesmixedinonecapsule,theadvantageofthestructureistoavoidtheinterferencebetweenenzymesandtoreducethemasstransferdistanceofintermediatereagents,resultinginhigherreactionvelocity.Thefabricationprocesswascarriedoutonarathermildcondition.Besides,highenzymeloadingwasachievedtoabout60%.Reactionvelocityforenzymesinshell-in-shellmicrocapsulewasabout15~30%highercomparedtomixtheenzymesinonemicrocapsule.Afterrepeatedlyusedforsixtimes,enzymesstillkeep65%ofitsinitialactivity.
Keywords:
multienzyme;immobilization;biomimeticsilicification;self-assembly;artificialcell;glucoseoxidase;horseradishperoxidase
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摘要1
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第一章文献综述1
1.1酶的固定化1
1.1.1酶固定化方法1
1.1.2固定化酶评价3
1.2仿生硅化及层层组装法的概念和应用4
1.2.1仿生硅化的概念及在固定化酶中的应用4
1.2.2层层组装法的概念及在固定化酶中的应用7
1.3人工细胞及多酶共固定的概念和应用9
1.3.1人工细胞的概念及应用9
1.3.2多酶共固定的概念及应用13
1.3.3本文选题思路及主要工作16
第二章Cell-likeshellinshell载体结构的制备17
2.1引言17
2.2实验过程17
2.2.1实验试剂及仪器17
2.2.2含PSS碳酸钙核的制备18
2.2.3层层组装制备精蛋白-氧化硅微囊18
2.2.4共沉淀制备碳酸钙覆盖球中球结构19
2.2.5分离出shellinshell结构19
2.2.6Shellinshell结构制备19
2.2.7Shellinshell结构表征19
2.2.8荧光标记蛋白的方法20
2.3结果与讨论20
2.3.1不同添加剂对碳酸钙分散效果的影响20
2.3.2不同方法对碳酸钙分离效果的比较22
2.3.3Cell-likeShellinshell结构的制备23
2.4小结28
第三章Cell-likeshellinshell载体包埋双酶—GOx和HRP的研究29
3.1引言29
3.2实验过程30
3.2.1实验试剂及仪器30
3.3.2碳酸钙核BSA包埋率的测定30
3.2.3三种含酶微囊的制备31
3.3.4GOx、HRP游离酶酶活的测定32
3.3.5GOx、HRP固定化酶活的测定33
3.3结果与讨论33
3.3.1碳酸钙核BSA包埋率33
3.3.2GOx、HRP游离酶最适温度35
3.3.3固定化酶反应稳定性的测定36
3.3.4三种微囊固定化酶活的比较37
3.4小结39
第四章结论与展望40
参考文献41
外文资料
中文译文
致谢
第一章文献综述
1.1酶的固定化
1.1.1固定化酶方法
酶是一种具有催化作用的蛋白质,具有很强的专一性、催化效率,是一种高效绿色节能的催化剂。
另外,由于酶催化反应条件温和,在医药、农业、化工、食品及生物技术领域有广泛的用途。
然而,由于游离酶的稳定性较差,活性随pH值及温度的变化较为明显,同时大多数酶是水溶性的,在水溶液中和反应物及产物较难分离,因此很难回收,这些因素均导致了使用酶的成本增加,限制了酶的应用。
为解决上述问题,在20世纪60年代开始,酶的固定化技术渐渐发展起来,这使得酶的稳定性增加,耐酸、耐碱性增强,反应后容易与产物进行分离,重复使用性增加。
因此固定化酶技术是酶工程中的研究热点[1]。
固定化酶的方法主要可分为四种[2,3]:
图1-1包埋酶的四种方法:
a)包埋法b)微囊法c)吸附法d)交联或共价结合法[3]
(a)包埋法:
将酶分子截留在具有特定网状结构载体中的一种固定化方法。
可分为凝胶包埋法、纤维包埋法、半透膜包埋法和辐射包埋法。
常用的包埋载体有天然高分子,如海藻酸钠、卡拉胶、明胶、琼脂糖等和合成高分子,如聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺凝胶等。
凝胶包埋法是将酶包埋于交联的水不溶凝胶分子中。
纤维包埋法是将酶溶液在高聚物(如醋酸纤维素)的有机溶剂中进行乳化,然后通过多孔喷丝头将乳化液挤压进入凝胶液中,形成丝状的纤维包埋体。
半透膜包埋法是将酶包埋于半透性聚合物膜内的固定化方法。
半透膜的孔径小于酶分子直径而大于底物、产物分子的直径,这样既可防止酶的泄露,又能是小分子底物产物顺利通过。
包埋法操作简单,由于酶分子只被包埋,未进行化学修饰,可得到较高的酶活;同时可以避免酶和外界环境的直接接触如机械剪切、气泡等,但此方法不适用于作用大分子底物或产物的酶的固定化[3]。
(b)微囊法:
将酶包埋于半透性聚合体膜内,形成微囊。
有四种制法:
界面聚合法、液体干燥法、分相法、脂质体法。
(c)吸附法:
通过氢键、疏水作用、离子键等物理作用将酶吸附于不溶于水的载体表面的固定化方法。
分为物理吸附和离子吸附。
物理吸附常用的载体有纤维素、骨胶原、氧化铅、硅藻土、高岭土、微孔玻璃等;离子吸附常用的离子交换介质有二乙基氨基乙基(DEAE)—纤维素、羧甲基(CM)—纤维素等。
吸附法操作简单,但是固定化酶在使用过程中容易受到pH、盐离子浓度而脱落。
(d)共价结合法:
通过酶分子表面的功能集团与载体表面的功能集团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法。
由于这种方法需要酶分子和载体分子提供活性基团参加反应,因此要根据不同的酶分子来选择不同的载体。
载体在选择时要考虑到其颗粒的大小、表面积、亲水性、化学集团组成等各种因素,常用的载体有纤维素、几丁质、壳聚糖、葡聚糖等。
共价法一般在反应前对载体进行活化,活化的方式分为多种。
这种固定化方法酶载体结合牢固,但制备过程复杂,反应中酶的活性有可能降低。
交联法:
利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子于惰性载体间进行交联,形成网状结构的固定化方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐等。
交联法操作简单,不溶于水,回收方便;具有较大的孔径,底物扩散阻力小;成本较低,容易实现多种催化剂共交联;但固定化过程中条件控制比较困难,制备的酶活力回收率较低,机械强度不足。
无载体固定化可分为四种,见图1-2:
(1)交联溶解酶(cross-linkeddissolvedenzymes,CLDEs)即对溶解状态的酶直接用交联剂交联,形成酶分子的复合物;
(2)交联酶晶体(cross-linkedenzymecrystals,CLECs),即将纯化的酶制备晶体,然后进行交联;
(3)交联酶聚集体(cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs);
(4)交联喷雾干燥酶(cross-linkedspray-driedenzymes,CSDEs);[2,3]
图1-2无载体固定化的几种形式[3]
不同的固定化方法均有其优缺点,在实际固定化过程中,常把各种方法联用以获得更好的效果。
1.1.2固定化酶评价
(1)固定化酶活力
定义为一定条件下固定化酶所催化的某一反应的初始速度。
活力单位可为μmol/(min·mg)或μmol/(min·cm2)。
相对酶活力:
具有相同蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。
用来反映固定化的酶的活力的变化。
(2)固定化酶的效率和酶的活力回收率
固定化酶的效率是指酶与载体结合的效率:
固定化酶的效率=(加入的总酶活力-未结合的酶活力)/加入的总酶活力×100%
未结合的酶活力包括固定化后滤出的固定化酶后的滤液以及洗涤固定化酶的洗涤液中所含的酶活力总和。
酶的活力回收率=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力×100%
(3)固定化酶温度和pH稳定性
固定化后,由于酶受到固定化酶的微环境的影响,酶的最适温度和pH都可能改变,以及对于两个因素的稳定性也可能改变,所以需要考察。
(4)固定化酶储存稳定性和重复使用稳定性
游离酶的稳定性较差,容易失活或者被微生物降解,固定化后稳定性上升。
酶活保持率=储存后的酶活力/初始酶活力×100%
游离酶一般在反应中仅使用一次,活力便丧失,固定化后,由于酶得到载体的保护,重复使用稳定性增加。
重复使用效率=第n次反应的酶活/第一次反应的酶活×100%
(5)固定化酶动力学参数的变化
米氏常数Km和最大反应速率Vmax,是酶的特征常数,Km值表示酶与底物亲和力的大小,Km增大表示酶与底物亲和力下降[1,4,5]。
1.2仿生硅化及层层组装法的概念和应用
1.2.1仿生硅化的概念及在固定化酶中的应用
生物矿化(biomineralization)是指在生物体系利用有机大分子和无机离子在界面处的相互作用,从分子水平控制矿物的析出、生长,使生物矿物有特殊高级结构和组装方式的形成过程[6]。
自然界中,人的牙齿、骨头,贝壳、硅藻细胞壁等都是由生物矿化过程产生的,这些结构都具有精妙的构造和高的机械性能、高的强度,是性能优越的材料,并且矿化过程的过程十分温和。
因此人们研究生物矿化的机理,希望能够模拟这种矿化过程,制造出性能优越的材料,应用于纳米微粒的合成、薄膜的合成、涂层材料、多孔材料的合成[7]。
其中,生物硅化用于固定化酶得到广泛的研究。
硅藻细胞可以从周围环境中吸收硅酸,将其储存在氧化硅沉积囊中(SDV),利用SDV中的蛋白质和糖类催化氧化硅成核和调控氧化硅结构,在生理条件下合成纳米尺度的具有高度有序结构的细胞壁[8,9]。
1998年,Morse课题组海绵动物中提取了蛋白质silicateins,并通过实验证明了这种蛋白质能够水解和缩聚二氧化硅前驱体如正硅酸乙酯[10]。
1999年,Sumper课题组从硅藻细胞中提取出蛋白质silaffins,并通过实验证明这种蛋白质具有催化硅酸单体缩聚的作用[11]。
图1-3Silaffin-1A结构式[11]
由于silicatein、silaffins等天然蛋白提取纯化比较困难,研究者在寻找其它具有催化仿生硅化功能的有机质(诱导剂)方面进行了大量研究。
通过模仿silaffins的阳离子(-NH3+)多肽结构,选择了如R5多肽、聚赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、聚组氨酸来用于在温和条件下催化氧化硅的生成,溶菌酶、精蛋白、嵌段共聚物多肽、聚乙烯亚胺(PEI)等含有丰富的阳离子分子也被证明可用来催化生成氧化硅[12]。
2004年,Luckarift等人利用R5多肽催化TMOS的水解液包埋丁酰胆碱酯酶,获得了包埋了丁酰胆碱酯酶的R5/氧化硅纳米颗粒,包埋率>90%,酶活性保持100%,提高了酶的稳定性,具有较高的机械强度,显示出来生物矿化用于包埋酶的优势[13]。
除了生物硅化被用于包埋酶,其他氧化物如氧化钛、氧化锆、氧化锗等也被可用于包埋酶[4,14]。
LorenaBetancor总结出生物硅化用于酶的固定和其特点:
表1-1仿生硅化固定化酶总结[12]
酶
硅的催化剂
固定化效率a
丁酰胆碱酯酶
过氧化氢酶
辣根过氧化物酶
大豆过氧化物酶
变位酶
β-半乳糖苷酶
硝基苯硝基还原酶
脂肪酶
葡萄糖异构酶
葡萄糖六磷酸脱氢酶
葡萄糖氧化酶
有机磷水解酶
葡萄糖pxidase
辣根过氧化物酶
荧光素酶
荧光素酶
绿色荧光蛋白
β-葡萄糖醛酸酶
R5,R5-His6,溶菌酶
R5
R5
R5
R5
R5
PEI
PEI
PEI
PEI
溶菌酶
溶菌酶
人工分子
人工分子
半胱胺
乙醇胺
乙醇胺
鱼精蛋白
>90%
100%
>90%
65—85%
44—67%
~90%
~60—80%
<10%
>40%
~33%
18—25%
ND
4—54%b
13—40%b
87%
17%
ND
77%
缩写:
GFP,绿色荧光蛋白;ND,没有检测;PEI,聚乙烯亚胺
a和包埋的蛋白相比,酶活力的保持
b固定化效率取决于反应条件
专栏1.生物矿化用于酶固定化的优势
快速。
固定在几秒钟内发生。
价格便宜。
不必合成一些化学反应试剂。
温和。
粒子的形成发生在室温中性pH值。
纳米。
低扩散限制与高体积活力。
巧妙。
网络结构可被溶解释放包埋酶。
强壮。
物理性能适合流通系统的应用。
稳定。
许多酶通过包埋在这种载体中得到稳定。
多形。
形状可以通过调整硅沉积不同的条件而获得。
综上所述,生物硅化用于酶的固定化诸多优势,得到了广泛的应用。
1.2.2层层组装法的概念及在固定化酶中的应用
20世纪90年代初,Decher等提出了基于聚合物阴阳离子静电作用的Layer-by-layer组装概念,即层层组装法[15]。
方法如下:
在模板核上交替吸附带有相反电荷或其他作用力的物质,最后去除核而得到中空结构。
自组装多层膜生长的驱动力除了静电作用还可以是氢键、共价键、配位键和疏水相互作用等,但研究最多的还是静电层层自组装。
用这种方法制备的微囊大小均一,且可由不同粒径的模板调控,囊壁壁厚、强度和渗透性可通过组装不同层数的聚电解质来调控,并可在纳米尺度上剪裁。
同时,LBL法制作工艺温和,可在常温水溶液中进行,可以保持生物分子的活性。
这些有点使得LBL法适合于包埋酶分子[5]。
图1-4层层组装及去核过程示意图[16]
层层自组装微囊模板材料:
[4,16]
模板的选择是LbL层层自组装微囊制备过程的一个关键问题。
合适的模板大多数情况下具有球形、均一的粒径,而且必须在自组装过程中保持完整稳定,在去除时模板的降解产物能够迅速并彻底与微囊分离,去除条件不能影响微囊囊壁的结构和稳定性。
常用的模板有:
(1)球形聚合物胶体粒子,如聚苯乙烯(PS)、三聚氰胺甲醛树脂(MF)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)等胶体粒子;
(2)盐的晶体或无机粒子,如球形的CaCO3、MnCO3微粒、SiO2粒子等;(3)生物细胞,如大肠杆菌、血红球等;(4)微乳液滴。
模板的去除方法取决于所用模板的性质以及微囊的用途。
如PS球形粒子可用四氢呋喃、甲苯等有机溶剂溶解;MF模板可在pH<1.7时降解,因此可用盐酸等去除;CaCO3可用盐酸、EDTA溶解去除;SiO2粒子模板可用HF溶解去除;红细胞可用次氯酸钠氧化去除。
表1-2制造中空微囊所用模板材料[46]
参数
甲醛聚氨
聚苯乙烯橡胶
硅
红血球
CdCO3CaCO3MnCO3
PLA,PLGA
大小µm
0.3-10
0.1-5
0.03-100
5.5-7.5
3-8
0.2-20
形状
球
球
球
discocyte
多孔
球
单分散性
非常好
非常好
好-非常好
好
中等
不好
是否可以买到
+
+
+
+
-
+/-
价格
非常高
中等
低
低
/
低
需要解决的问题
机械强度、残留物
机械强度、残留物
团聚
化学压力、壁破碎
/
残留物
层层自组装微囊囊壁材料:
囊壁材料的选择是LbL层层自组装微囊制备的另一个关键,这对实现微囊的功能化具有至关重要的意义。
目前,用于制备微囊的聚阳离子电解质主要是聚丙烯铵盐酸盐(PAH)和聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐(PDADMAC),聚阴离子电解质主要是聚苯乙烯磺酸钠(PSS)和聚丙烯酸(PAA)。
迄今为止,研究最多的体系是PAH/PSS组合。
随着LbL微囊在生物活性分子包埋和药物释放领域的研究和应用越来越广泛,研究者对天然聚电解质和生物相容性较好的聚电解质研究
日渐增多。
多糖类如海藻酸钠、壳聚糖、羧甲基纤维素、硫酸葡聚糖,多肽如精蛋白、聚赖氨酸和聚谷氨酸等都已成功用于LbL自组装微囊的制备。
由于LBL法不需要昂贵的仪器和特殊的方法,所以在很多方面得到了应用:
膜的制备、光学仪器的制备、电极材料的制备、生物分子的包埋、药物释放等领域[16]。
层层自组装微囊在固定化酶中的应用
层层组装作为一种制作微囊的方法,有许多优势,因此也被用来制备包埋酶或其他生物活性分子的微囊。
如Zhao等在以碳酸钙为模板,碳酸钙中加入了硫酸软骨素CS,在模板的基础上交替吸附五个双层聚赖氨酸PLL和CS,同时加入戊二醛GA进行交联,最后用EDTA去核,由此获得的微囊能够在不同的pH下装入或者释放BSA,是一种潜在的药物控制释放的载体[49]。
图1-5GOD和CAT酶的偶联反应提高微囊壁渗透性释放胰岛素的示意图[50]
Qi等以胰岛素粒子为模板,交替吸附一定层数的葡萄糖氧化酶GOD和过氧化氢酶CAT,以戊二醛进行交联,当粒子接触到葡糖糖后,葡糖糖被GOD氧化生成葡糖糖酸,pH下降,使得粒子的膜层微环境改变,通透性增加,粒子内的胰岛素逐渐的释放[50]。
1.3人工细胞及多酶共固定的概念和应用
1.3.1人工细胞的概念及应用
人工细胞,在文献中分为两类,一类是利用化学方法合成的,称为artificialcell、syntheticcell、organelle、protocell、primitivecells等[17,18,22-24],另一类是利用生物方法创造的自然界中不存在的所谓的minimalcell[19-21]。
前一种方法称为bottom-up[22-24],从下至上的方法,即利用化学方法将基本的化学分子组装起来获得具有一定功能的模拟细胞的微囊;后一种方法称为top-down[20,21],从上至下的的方法,即敲除生物中一些不必要的基因直至得到可以存活的最小基因组[26,27]。
图1-6源于LBL微囊的模拟细胞和亚细胞的结构示意图[30]
图1-7纳米工厂的六种机制:
1)支架2)运输3)感应4)包埋空间5)靶向6)响应[28]
人工细胞的建立能够使人们认识生命起源的过程,还可以将人工细胞应用于医学领域、药物传递、酶的固定化等[29,30]。
Bottom-up一般是化学家所采用的方法,合成细胞外壳的物质和方法通常有脂质体、聚合物polymersomes、乳液法形成的外壳、层层组装法形成的外壳。
如,将一系列酶包埋于脂质体里,合成了蛋白质[25]。
将大肠杆菌的细胞提取液、绿色荧光蛋白基因利用乳液法包埋在脂质体里,形成微囊结构,将微囊放于含有核苷酸和氨基酸的溶液里,可以检测到绿色荧光蛋白的表达,若将α-溶血素包在脂质体里,可使绿色荧光蛋白的表达时间持续4天[22]。
用聚合物isocyanopeptides和苯乙烯将葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase),脂肪酶(CandidaantarcticalipaseB)和辣根过氧化酶(horseradishperoxidase)三种酶分别包埋于纳米小球的表面、球内和膜中[33]。
以硅为模板,层层组装形成外膜后去除模板,得到含有DNA和核酸内切酶的微囊,加入二价阳离子后,DNA被降解[34]。
Bacteriorhodopsin(BR)是一个光驱动的跨膜离子泵,维持着膜内外的质子浓度差,
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