调节性T细胞在肝再生增强因子免疫抑制机制中的作用研究.docx
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调节性T细胞在肝再生增强因子免疫抑制机制中的作用研究
3结果
3.1hALR对纯化T淋巴细胞的影响
FCM检测结果显示,纯化前和纯化后细胞相比,PE标记的抗人CD3+T细胞的纯度达到99%,可以用于后续的实验。
培养60h后,与Normal组相比,ConA组对纯化的T淋巴细胞无促进增殖作用P>0.05;与ConA组、hALR组相比,ConA+hALR组对T细胞无抑制作用P>0.05;hALR组对T细胞既无促进增殖作用也无抑制作用,图1。
图1流式检测T淋巴细胞增殖情况
Fig.1FlowcytometryofproliferationofTcell
3.2hALR对纯化T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的影响
60h时,流式结果显示,在CD4+T细胞基础上分析CD25和Foxp3的比例情况。
与Normal组相比,ConA组不能促进CD4+T细胞中CD25+Foxp3+细胞比例增加P>0.05;与ConA组、hALR组相比,ConA+hALR组也不能促进CD4+T细胞中CD25+Foxp3+细胞比例增加P>0.05;hALR组对CD4+T细胞中CD25+Foxp3+细胞比例既无促进增加作用也无抑制作用,图2。
图2流式检测纯化T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例
Fig.2FlowcytometryofCD4+CD25+Foxp3+TreginpurifedTcells
3.3hALR对纯化T细胞上清中细胞因子水平的影响
60h时,ELISA检测上清中TGF-β1的水平。
结果显示:
与Normal组相比,ConA组不能刺激上清中TGF-β1分泌增加P>0.05;与ConA组、hALR组相比,ConA+hALR组上清中TGF-β1的分泌也无明显增加P>0.05;hALR组对上清中TGF-β1既无促进分泌增加作用也无抑制分泌作用,见表1和图3。
表1纯化T淋巴细胞上清中TGF-β1的浓度(pg/ml)
Table1TheConcentrationofTGF-β1inthesupernatantofpurifedTcells
Group
TGF-β1(pg/ml)
Normal
49.03
5.14
ConA
49.28
20.16
ConA+hALR
57.20
14.51
hALR
36.58
2.16
图3各组纯化T淋巴细胞上清中TGF-β1的浓度
Fig3TheConcentrationofTGF-β1inthesupernatantofinpurifedTcells
60h时,ELISA检测上清中IL-10的水平。
结果显示:
与Normal组相比,ConA组不能刺激上清中IL-10分泌增加P>0.05;与ConA组、Normal组相比,ConA+hALR组上清中IL-10的分泌也无明显增加P>0.05;hALR组对上清中IL-10既无促进分泌增加作用也无抑制分泌作用,见表2和图4。
表2纯化T淋巴细胞上清中IL-10的浓度(pg/ml)
Table2TheConcentrationofIL-10inthesupernatantofinpurifedTcells
Group
IL-10(pg/ml)
Normal
29.47
0.11
ConA
29.21
0.02
ConA+hALR
29.30
0.28
hALR
29.27
0.11
图4各组纯化T淋巴细胞上清中IL-10的浓度
Fig4TheConcentrationofIL-10inthesupernatantofinpurifedTcells
3.3hALR对PBMC增殖情况的影响
各组细胞培养24h,48h,60h后,EdU检测结果显示:
Normal组由于未经刺激,PBMC没有增殖,在三个时间点均未见增殖;ConA组经刺激后PBMC增殖明显,48h和60h促增殖作用显著,与相应Normal组相比P<0.01;ConA+hALR组能明显抑制PBMC增殖,48h和60h抑制作用明显,与相应ConA组、hALR组相比P<0.01;hALR组对PBMC既无促进增殖作用也无抑制作用。
ConA组促进细胞增殖作用随时间增加而逐渐增强,48h和60h与24h相比,有统计学差异P<0.01;ConA+hALR组对PBMC的抑制作用随时间增加而逐渐增强,48h和60h与24h相比,有统计学差异P<0.01,图5。
注:
*与Normal组相比分别是P>0.05,#与ConA组、hALR组相比P>0.05
*ascomparedwithNormalgroupP>0.05,#ascomparedwithConAgroupandhALRgroupP>0.05
注:
*与Normal组相比分别是P<0.01,#与ConA组、hALR组相比P<0.01
*ascomparedwithNormalgroupP<0.01,#ascomparedwithConAgroupandhALRgroupP<0.01
3.4hALR对PBMC中Treg细胞比例的影响
各组细胞培养24h、48h、60h后,流式检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,结果显示:
在CD4+T细胞基础上分析,Normal组由于未经刺激,CD25+Foxp3+细胞比例未见增加,在三个时间均未见细胞比例变化;ConA组经刺激后能增加CD25+Foxp3+细胞比例,48h和60h作用明显,与相应Normal组相比P<0.01、P<0.05;ConA+hALR组能更显著增加CD25+Foxp3+细胞比例,48h和60h作用更明显,与相应ConA组、hALR组相比P<0.01;hALR组对CD25+Foxp3+细胞比例既无促进增加也无减少作用。
ConA组增加CD25+Foxp3+Treg细胞比例随时间增加而逐渐增强,48h和60h与24h相比,有统计学差异(P<0.01);ConA+hALR组增加CD25+Foxp3+Treg细胞比例随时间增加而逐渐增强,48h和60h与24h相比,有统计学差异(P<0.01),图6。
3.5PMBC中树突状细胞表面分子的影响
各组细胞培养24h、48h、60h后,通过对DC表型标记,流式结果显示:
我们首先选出CD11c和HLA-DR双阳性细胞,在此基础上选出CD123和CD11c阳性细胞,并在CD123和CD11c阳性细胞细胞基础上选出CD86阳性细胞数。
24h时,ConA组中DC细胞表面分子CD86表达未降低,与Normal组相比P>0.05;ConA+hALR组也不能降低CD86表达。
48h时,ConA组能明显降低CD86分子的表达,与Normal组相比P<0.01;ConA+hALR组不能降低CD86表达,与ConA组相比P>0.05。
60h时,ConA组能明显降低CD86分子的表达,与Normal组相比P<0.01;ConA+hALR组能更显著抑制CD86的表达,与ConA组、hALR组相比P<0.01,图7。
3.6hALR对PBMC上清中细胞因子分泌的影响
各组细胞培养24h、48h、60h后,TGF-β1结果显示:
Normal组由于未经刺激,上清中TGF-β1浓度较低,三个时间点均未见浓度变化;ConA组经刺激后能增加上清中TGF-β1浓度,48h和60h增加明显,与相应Normal组相比P<0.01;ConA+hALR组能更显著增加上清中TGF-β1浓度,48h和60h作用明显,与相应ConA组、hALR组相比P<0.01;hALR组上清中TGF-β1分泌较Normal组稍有增加,但在三个时间点却均未见浓度变化。
ConA组增加上清中TGF-β1浓度随时间增加而逐渐增强,48h和60h与24h相比,有统计学差异P<0.01;ConA+hALR组增加上清中TGF-β1浓度随时间增加而逐渐增强,48h和60h与24h相比,有统计学差异P<0.01,表3、图8。
表3PBMC细胞上清中TGF-β1的浓度(pg/ml)
Table3TheConcentrationofTGF-β1inthesupernatantofgroup
24h
48h
60h
Normal
49.03
7.90
47.77
10.21
58.43
10.49
ConA
73.63
24.35
324.26
32.59*$
559.43
10.97*$
ConA+
hALR
82.52
19.32
737.25
4.29*#&
1016.21
41.37*#&
hALR
61.13
17.12
52.90
3.00
65.23
14.17
$ascomparedwithConAgroupof24hP<0.01,&ascomparedwithConA+hALRgroupof24hP<0.01,*ascomparedwithNormalgroupP<0.01,#ascomparedwithConAgroupandhALRgroupP<0.01
60h时,IL-10的ELISA结果显示:
Normal组细胞未经刺激,上清IL-10浓度较低;ConA组细胞经过刺激后其上清中IL-10浓度明显增加,与Normal相比P<0.01;ConA+hALR组上清中IL-10浓度增加更明显,与ConA组和hALR组相比P<0.01;hALR组IL-10的浓度较Normal组增加,与Normal组相比P<0.01,表4、图9。
表4PBMC细胞上清中IL-10的浓度(pg/ml)
Table4TheConcentrationofIL-10inthesupernatantofgroup
Group
IL-10(pg/ml)
Normal
15.16
1.74
ConA
200.18
16.42*
ConA+hALR
868.49
76.76*&
hALR
108.31
6.62*
*ascomparedwithNormalgroupP<0.01,&ascomparedwithConAgroupandhALRgroupP<0.01
3.7加入TGF-β1抗体后的结果
3.7.1加入TGF-β1抗体后PBMC增殖情况
体外培养60h后,EdU检测结果显示:
与Normal组相比,ConA组能明显刺激PBMC的增殖P<0.01;与ConA组相比,ConA+hALR组能明显抑制PBMC增殖P<0.01;而与ConA+hALR组相比,ConA+hALR+anti-TGF-β1组PBMC增殖变化并不明显P>0.05,图10。
3.7.2加入TGF-β1抗体后Treg细胞比例的变化
体外培养60h后,结果显示:
在CD4+T细胞上分析,与Normal组相比,ConA组能促进CD25+Foxp3+细胞比例增加P<0.01;与ConA组相比,ConA+hALR组能更显著促进CD25+Foxp3+细胞比例增加P<0.01;与ConA+hALR组相比,ConA+hALR+anti-TGF-β1组能显著抑制CD25+Foxp3+细胞比例增加P<0.01,hALR组CD25+Foxp3+Treg细胞比例较Normal组增多,但却无统计学意义P>0.05;图11。
4讨论
ALR是Hagiya等[3]在1994年发现的能促进肝细胞DNA合成的细胞因子,具有强大的免疫功能,但其发挥免疫抑制作用的机制还不清楚。
因此,本研究主要探讨hALR发挥免疫抑制作用的可能机制。
4.1hALR对纯化T细胞的作用
机体免疫细胞的增殖除了遵循细胞增殖的调控规律外,还要遵循免疫系统对细胞的调控作用。
本研究中我们以ConA作为刺激剂,采用EdU(5-Ethynyl-2,-deoxyuridine)检测细胞增殖。
ConA即刀豆蛋白A,具有强烈的促有丝分裂的作用,是重要的促T细胞活化的丝裂原。
EdU[36]是种胸腺嘧啶核苷酸类似物,能够在细胞增殖过程中替换胸腺嘧啶(T)渗入到正在复制的DNA分子中,Apollo®荧光燃料通过与EdU特异性的反应从而检测细胞DNA复制情况,这种检测方法更快速、灵敏、准确。
我们通过EdU检测纯化T细胞增殖情况发现,ConA不能促进T细胞增殖,而hALR对ConA处理的T细胞无抑制作用,这似乎与ConA能促进T细胞增殖的理论相悖,但ConA对T细胞的促增殖作用是抗原提成细胞依赖的,也就是说,在ConA促进T细胞增殖的培养体系中抗原提成细胞必不可少,而我们T细胞的纯度高,几乎不含除T细胞以外的其他细胞,因此不能刺激T细胞增殖。
hALR对ConA处理的T细胞无抑制作用,那么hALR对T细胞中Treg细胞比例是否会有影响。
我们通过标记Treg细胞特征性分子CD4、CD25、Foxp3,观察T细胞中Treg细胞比例的变化。
结果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例在各组中均无明显差异,提示hALR对于ConA处理的T细胞中Treg细胞无促进比例增加的作用;同时,我们还检测了T细胞上清中TGF-β1和IL-10的水平,结果与Treg细胞一致,即hALR对ConA处理的T细胞不能促进上清中TGF-β1和IL-10水平增加。
这些结果提示hALR对ConA处理的T细胞无免疫抑制作用。
但是我们前期研究结果显示hALR能抑制ConA刺激的外周血单个核细胞中T淋巴细胞的增殖,而本研究中hALR对纯化T细胞却并未观察到相似的结果,这就提示hALR可能不能直接作用于纯化T淋巴细胞,而是需要在其他细胞或细胞因子存在的情况下才能实现。
4.2hALR对PBMC的作用
既然hALR对纯化T细胞不能发挥免疫作用,因此我们用hALR作用于PMBC,观察会有哪些变化,继续研究hALR的免疫抑制机制。
我们同样采用EdU检测各组细胞的增殖情况,结果显示,hALR对未经ConA刺激的PBMC既无促进增殖作用也无抑制作用;ConA能促进PBMC增殖,随着时间延长,促进作用也更明显;而hALR对ConA刺激的PBMC具有明显的抑制作用,随着时间延长,抑制作用也更明显,这些提示hALR具有负性免疫调节作用。
前期我们研究证实ALR对活化的淋巴细胞可以通过内外源性两条途径抑制其凋亡[37],说明ALR不会通过诱导细胞凋亡来抑制细胞增殖。
有研究证实被抗原活化的Treg细胞可以抑制T细胞增殖[38]。
因此,我们通过对PBMC中Treg细胞比例进行检测,研究ALR发挥免疫抑制作用的机制。
我们发现随着时间的增加,ConA能促进CD4+细胞中C25+Foxp3+细胞比例增加,而hALR能更显著增加ConA刺激的PBMC中CD4+细胞中C25+Foxp3+细胞的比例,提示Treg细胞比例增加可能与hALR的免疫抑制作用有关。
树突状细胞是功能最强大的专职抗原提呈细胞(APC),根据来源分为髓系树突状细胞(Myeloiddendriticcells,mDC)和浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoicytoiddentriticcells,pDC),根据免疫表形分为成熟DC和不成熟DC,成熟DC高表达MHC-I、MHC-II分子、协同刺激分子B7分子(CD80、CD86)、CD11c、CD123等,其抗原提呈、激发免疫应答的能力强;而不成熟DC则正好相反,其表面分子表达低,提呈抗原能力弱,但加工处理抗原的能力强,可以通过诱导Treg细胞的比例增加或促使效应T细胞无能引起免疫耐受。
实验中常选MHC-I/MHC-II、CD80或/和CD86来反应DC细胞的成熟度[39]。
CD11c和CD123也是DC细胞特异性表面标记,因此本研究中选用CD11c、MHC-II、CD86、CD123来检测DC表型变化,结果发现24h和48h时hALR均不能降低ConA刺激的PMBC中DC细胞CD86分子的表达,提示DC细胞在24h和48h可能与hALR的免疫抑制作用无关;60h时,ConA可以降低DC细胞CD86分子表达,而hALR能更显著降低ConA刺激的PBMC中DC细胞CD86分子的表达,提示hALR可以下调DC细胞免疫表型,可能通过使效应T细胞增殖减少从而抑制免疫反应。
TGF-β可以由多种免疫细胞产生[40],具有三种亚型,分别是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,其中TGF-β1含量最多,同时也是免疫系统中的主要表达形式[41]。
TGF-β有多种生物学功能,如调节细胞生长、分化、凋亡等[42],同时TGF-β还具有强大的免疫抑制作用和诱导免疫耐受的作用。
本研究中我们发现随着时间的增加,ConA能促进PMBC上清中TGF-β1水平增加,而hALR能更显著促进ConA刺激的PMBC中TGF-β1水平增加,提示TGF-β1可能参与了hALR对ConA刺激的PBMC增殖的抑制作用。
由于TGF-β1的浓度变化趋势与Treg细胞的变化趋势一致,提示TGF-β1可能对Treg细胞具有诱导比例增加的作用。
IL-10可以由Th2型细胞、巨噬细胞、DC细胞、Treg细胞、Th17细胞产生,是细胞因子中干扰素家族成员[43],具有强大的抑制免疫细胞激活及增殖和抑制细胞因子产生的作用[45],其机制有
:
通过阻断巨噬细胞向Th1细胞提呈异物抗原;
:
阻断巨噬细胞表达MHC-I类分子、B7分子、ICAM-1;
:
抑制Th1型细胞分泌IL-2;
:
抑制APC提呈抗原给CD4+T细胞进而抑制CD4+T细胞的活化增殖等[44]从而发挥免疫抑制作用。
本研究中IL-10在各组也表现出了明显的趋势,即ConA能促进IL-10的分泌增加,这可能是为防止ConA刺激PBMC过度分化增殖而起负向调控的作用,hALR更显著促进了ConA刺激的PBMC中IL-10的分泌增加,结合60h时hALR可以下调ConA刺激的PBMC中DC细胞免疫表型,提示IL-10在hALR的免疫抑制作用中一方面直接发挥其免疫抑制作用,另一方面可能通过诱导DC细胞不成熟,使DC细胞提呈抗原能力减弱进而发挥免疫抑制作用。
4.3TGF-β1抗体在hALR影响Treg细胞比例中的作用
研究报道称TGF-β可以促进Treg细胞分化成熟[43],而我们实验结果也证实hALR促进ConA刺激的PBMC中TGF-β1分泌增加和Treg细胞比例增加,那么TGF-β1和Treg细胞之间有何关联。
我们通过鼠单克隆TGF-β1抗体中和TGF-β1后观察Treg细胞比例在各组间的变化。
通过在ConA+hALR组中加入抗TGF-β1抗体后,我们发现Treg细胞比例较ConA+hALR组明显降低,提示hALR对ConA刺激的PBMC中Treg细胞的促进比例增加作用在加入TGF-β抗体后能有效逆转,提示TGF-β在促进Treg细胞比例增加中有重要作用,这就更加证实了前面的结果;但Treg细胞的比例仍然高于Normal组,提示hALR可能反馈性增强了诱导Treg细胞产生的其他途径,从而诱导Treg细胞比例增加。
然而TGF-β抗体诱导的Treg细胞减少却不能改变hALR对ConA刺激的PBMC的抑制作用,这可能是由于
:
TGF-β1抗体诱导Treg细胞比例减少后反馈性增强了Treg细胞产生的其他途径,因为TGF-β1对Treg细胞的诱导比例增加作用只是Treg产生的其中一条途径,还存在其他途径,如不成熟DC细胞可以诱导初始T细胞分化为具有免疫抑制作用的Treg细胞[46],因此,可能出现代偿性其他通路增强,Treg比例增加,
还有研究称体外TGF-β抗体并不能阻断Treg细胞的抑制作用,
本研究中观察到IL-10在ConA+hALR组分泌显著增加,由于多种细胞均可产生IL-10,因此,在加入TGF-β抗体后可能使IL-10的免疫抑制作用也增强;
:
hALR对淋巴细胞的抑制作用还存在其他途径,如hALR通过抑制PKCα-NF-κB通路进而抑制IL-2的产生抑制淋巴细胞的增殖[47]、通过抑制ERK2磷酸化抑制淋巴细胞增殖,可能这些途径代偿增强等,提示hALR的免疫抑制作用可能并非完全依赖TGF-β1诱导的Treg细胞。
全文总结
1:
ConA对纯化的T淋巴细胞无明显促增殖作用,也不改变Treg细胞的比例和影响TGF-β1和IL-10分泌。
2:
hALR单独或与ConA一起对纯化的T淋巴细胞增殖、Treg细胞的比例以及TGF-β1和IL-10的分泌均无明显影响。
3:
ConA可以促进PBMC增殖,促进Treg细胞比例增加和TGF-β1分泌增加;hALR能抑制ConA刺激的PBMC增殖,促进Treg细胞比例增加和TGF-β1分泌增加;hALR还能促进ConA刺激的PBMC中IL-10的分泌增加,提示hALR对ConA刺激的PBMC的抑制作用可能是通过Treg细胞、TGF-β1、IL-10共同或/和部分起作用。
4:
hALR可以抑制ConA刺激的PBMC中DC细胞表面CD86的表达,使DC细胞表面分子表达降低,可能诱导效应T细胞增殖减少从而抑制免疫反应。
5:
TGF-β1抗体能有效逆转hALR对Treg细胞促进比例增加的作用,但却不能逆转hALR对PBMC增殖的抑制作用,提示hALR的免疫抑制作用可能是多因素参与的过程。
综上,本研究初步探讨了hALR发挥负向免疫作用的机制,然而研究还有待深入。
Treg细胞发挥免疫抑制作用可以通过细胞-细胞接触方式和/或分泌细胞因子起作用,由于本研究在DC细胞与Treg细胞、DC细胞与IL-10、Treg细胞与IL-10之间是否存在相互作用关系,还未研究清楚。
因此,今后将从这几个方面研究其相互作用关系,明确hALR的免疫抑制机制。
文献综述
调节性T细胞在肝脏相关疾病中作用的研究进展
摘要:
调节性T淋巴细胞(RegulatoryTcell,Treg)是一类具有免疫调节作用的重要的淋巴细胞亚群。
它们既能调控机体的免疫反应强度,控制变态反应,维持自身免疫耐受,又能参与肿瘤免疫逃逸、移植耐受诱导等的发生发展过程。
研究发现调节性T细胞与肝脏疾病有很大联系,因此,本文就调节性T细胞与肝脏相关疾病做总结。
关键词:
肝脏、CD4+CD25+调节性T细胞、免疫调节
1调节性T细胞的概述
调节性T细胞是Sakaguchi[1]等1995年在成年大鼠中发现的一类淋巴细胞亚群,该亚群高表达IL-2(Interleukin-2)受体α链,即CD25。
Treg细胞除了高表达CD25外,还表达CTLA-4、CD45RB、CD103、低表达CD127[2]、其中Foxp3(FoxkheadboxP3),属于叉头/翼状2螺旋转录因子家族,基因定位于X染色体p11.23,人Foxp3cDNA全长约为1869bp,编码约431个氨基酸的蛋白,高表达于Treg细胞核内,是Treg细胞分化增殖、发挥功能的关键因子,能影响细胞的发育和调节功能[3、4]。
调节性T细胞根据其功能分类为天然来源的调节性T细胞(NaturallyoccurringregulatoryTcell,nTreg)和诱导的调节性T细胞(Inducedregulato
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