基因工程知识点.docx
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基因工程知识点
基因工程期末考点
<第一讲>
1.格里菲斯实验:
用粗糙型(R,无毒)和光滑性(S,有毒)肺炎链球菌注射小鼠,用R单独注射时,小鼠存活;S则小鼠死亡;高温加热杀死的S则存活;R+高温加热杀死的S菌株混合注射,小鼠死亡:
S型菌种含有某种转化因子将R转变为S,导致小鼠死亡
2.艾弗里实验(体外转化实验):
分离出蛋白质、脂类、多糖和DNA,转入到小鼠体内,初步证明DNA是遗传物质,但是存在争议(DNA和蛋白质未完全分离)
3.AlfredHershey、MarthaChase(译赫尔希、蔡司)噬菌体侵染实验,证明DNA是遗传物质
4.Waston、Crick、威尔金斯、富兰克林DNA双螺旋模型
5.MatthewMeselson、FranklinStahlDNA半保留复制
6.MarshallW.Nirenberg、HarG.Khorana、RobertW.Holley密码子破译
7.镰刀型贫血症:
血红蛋白第六位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸
8.胰岛素:
加拿大科学家Banting、Best、科利普、麦克莱德发现,是糖尿病治疗史上的里程碑(LiLy公司)
9.StanleyCohen(斯坦福大学)+HerbertBoyer(加州大学)重组DNA技术,基因重组得人胰岛素(礼来和诺和诺德公司)
10.1990年,第一例临床基因治疗患者为四岁女孩AshantideSilva,缺乏腺苷脱氢酶ADA基因而患有严重综合性免疫缺陷症,研究者W.F.Anderson将ADA基因导入患者淋巴细胞,再将改造后的淋巴细胞回输到患者体内
11.HIV唯一治愈病人柏林病人TimothyRayBrown(同时患HIV和白血病,CCR5受体)
12.基因编辑技术:
ZincFinger;TALEN;CRISPR
<第二讲>
1.基因操作工具酶:
酶在DNA分子水平的操作中,依赖于一些重要的酶,如限制性核酸内切酶、连接酶等,作为工具对DNA进行切割和拼接,这些酶统称为基因工程工具
2.内切酶:
在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开的工具酶酶,如EcoRI,HpaI。
3.DNA聚合酶:
以DNA为模板,沿5’→3’方向将游离脱氧核苷酸不断连接到正在合成的新DNA链上的DNA合成酶。
4.DNA连接酶(了解):
催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3'羟基和5'磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键,使断开的DNA裂口连接起来的工具酶(通常使用来自T4噬菌体的DNA连接酶和大肠杆菌连接酶;前者以ATP作为辅助因子,后者需要NAD+作为能源;;二者都能连接平末端和黏性末端;T4DNA连接酶应用更广泛一些)
5.鉴于对核酸的不同作用,将相关酶分为核酸水解酶类(核酸内切酶、核酸外切酶)、核酸合成酶类(DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA连接酶)以及核酸修饰酶类(甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸转移酶、磷酸酶)
6.常用工具酶及其功能
7.限制性内切核酸酶<定义>:
是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶,简称为限制酶。
(一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切割点上将DNA分子切断)
①作用特点:
1)专一性(一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子);2)多样性(限制酶有200多种);3)限制酶识别的特定序列通常是由4-6个碱基对组成的具有回文序列的DNA片段,并在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键;4)不同酶识别的碱基数目不同,一般为4、5、6个碱基对;5)识别序列碱基对越多,则这种酶在DNA上出现的频率越低;6)不同生物其碱基含量不同,酶识别位点的分布及频率也不同;7)大多数限制酶是错位切割双链DNA产生5’或3’粘性末端
能在特异位点(酶切位点)上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。
②作用结果:
产生黏性末端或平末端
③分类:
限制酶主要分布在微生物中,分为三类:
即I型、II型、III型酶。
I型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性,又因其识别位点与切割位点不固定,所以价值不大;II型酶切割DNA片断活性和甲基化作用是分开的,且核酸内切作用又具有序列特异性,识别、切割特殊的回文序列,在基因克隆中广泛使用。
(通常所用的限制性核酸内切酶都是指II型)
8.粘性末端:
被限制酶切开的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对,这样的切口叫做黏性末端
平末端:
部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA双链,产生平末端
限制性内切酶酶切产生两种结果(粘性末端和平末端)/三种结果(5’、3’粘性末端和平末端),粘性末端效率高
9.命名(了解)
采用Smith和Athens提议的方案,根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名用来源细菌的英文缩写斜体符号命名:
它的第一个字母大写,来源细菌属名的第1个字母;第二、三字母小写,来源细菌种名的头2个字母;第四个字母代表菌株;最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号(如HindIII,H为属名第一个字母in为种名头两个字母d为菌株名Rd中的d,III说明是在该菌株中发现的第三种限制性核酸内切酶)
10.同尾酶:
来源不同、识别序列不同但可以产生相同粘性末端的酶称为同尾酶(BamHI和BglIISalI和XhoI)
同位酶:
识别相同序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶(相同序列不同末端SmaI和XmaI)
11.影响内切酶酶切反应的条件(简答题)
①温度:
一般37℃②盐离子浓度:
Na+,Mg2+
③缓冲体系:
具有稳定pH环境的Tris-HCl缓冲体系DTT(二硫苏糖醇)用于保持酶稳定性和活性
④反应体积和甘油浓度:
商品化的限制性内切核酸酶均加50%甘油作为保护剂,一般在-20℃保存。
酶切反应时,加酶的体积一般不超过总反应的10%,否则甘油浓度过高,影响酶切反应
⑤反应时间:
通常为1h;进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜
⑥DNA纯度和结构:
一个酶单位定义:
1h内完全酶解1μgλ噬菌体DNA所需的酶量
DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度
酶切的底物一般为双链DNA,DNA的甲基化位置会影响酶切反应
12.“星”活性:
酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性(非特异性切割)
13.DNA连接酶连接的部位是磷酸二酯键(梯子的扶手),其作用过程分为3步:
(简答题)
连接酶与辅助因子ATP或NAD+形成酶-AMP复合物
AMP作用于DNA缺口的5’-末端磷酸基团
缺口3’-OH对活跃的磷原子作亲核攻击,形成新的磷酸二酯键,封闭切口
13.DNA连接酶的反应条件
1连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。
多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37℃,但在该温度下粘性末端之间的氢键结合是不稳定的,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折中,所以连接反应一般采用16℃过夜
2DNA浓度:
外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍;由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多,故在平末端连接反应中,T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高
3防止环化:
碱性磷酸酶预先处理质粒载体
4时间:
过夜最好
14.平末端DNA片段的连接
直接用T4DNA连接酶连接:
效率不高,较少采用
同聚物连接平末端DNA片段:
先用末端核苷酸转移酶,给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接
用衔接物连接平末端DNA分子:
目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点,经酶切后产生特异的粘性末端,从而与具有互补末端的DNA连接(衔接物:
指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段)
15.重组DNA实验的一般程序
1选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶(如EcoRI)作位点特异的切割,形成全长的具粘性末端的线性DNA分子
2再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化
3混合,加入DNA连接酶。
由于具有相同的(如EcoRI)粘性末端,能退火形成双链结合体。
其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后,便产生稳定的杂种DNA分子
16.逆转录酶:
亦称为反转录酶,是依赖于RNA的DNA聚合酶,以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)合成互补DNA链(cDNA)的酶。
17.碱性磷酸酶
功能:
催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’端磷酸基团,以防发生自身连接
用途:
在用γ-P32磷酸和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA之前,进行碱性磷酸酶处理;在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接
18.其他功能酶(了解)
磷酸激酶:
对核酸末端羟基进行磷酸化的酶作用:
①放射性标记DNA链5’末端,探针标记②Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析使缺少5’磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化特性:
①很难纯化,酶制品常不纯;②铵离子是该酶的强烈抑制剂;③低浓度的磷酸也可抑制该酶的活性
末端脱氧核苷酸转移酶:
来自小牛胸腺作用:
在一定条件下,催化将一个一个的脱氧核苷酸,沿着5’→3’加到DNA链的3’-OH末端。
该过程不需要DNA模板,对双链、单链DNA都适用。
经常用于人工粘性末端的构建
甲基化酶:
能识别限制酶识别的序列,识别顺序中的某个碱基发生甲基化(常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰),属修饰酶类。
经修饰的DNA不再被限制酶降解;细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)来完成的。
甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序,真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(m5c)
<第三讲>
1.
2.载体<定义>:
携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA分子
载体三元件:
①能在宿主细胞中复制并稳定地保存---具复制原点(ori):
在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能与携带的外源DNA一起复制②能与目的基因连接---具多个限制酶切点,而每一个这样的酶切位点在载体DNA中只有一个(广泛、特异)③便于筛选鉴定---具有标记基因,这种选择标记基因通常是抗菌素基因或某种酶基因,而宿主细胞并不具有
按作用分:
将载体分为克隆载体(可以克隆和运载目的基因并转移到宿主细胞中进行复制和扩增)、表达载体(克隆、运载和转移目的基因到受体细胞中进行复制和扩增)和穿梭载体(能在两种不同的生物中复制的载体,既能在原核生物又能在真核生物复制)
3.各种DNA载体比较(master)
4.质粒<定义>:
质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。
(质粒是基因工程中最常用的运载体,而最常用的质粒的是大肠杆菌的质粒)
质粒载体的修饰改造:
①去掉不必要的DNA区域,只保留质粒复制必须部分,以提高外源DNA装载量②减少质粒内限制性内切酶位点,质粒酶切位点过多,给克隆外源DNA造成不便③加入选择性标记:
通过质粒间的重组使质粒携带合适标记,常用的有抗生素抗性标记。
如:
氨苄青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等④安全性能改造:
不能随便转移,以免污染环境⑤改造或增加基因表达的调控序列:
比如加入强启动子
发展概况(了解):
第一阶段(1977年前):
天然质粒和重组质粒的利用,如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322第二阶段:
增大载体容量(降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。
如pUC系列载体第三阶段:
完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如M13mp系列载体,含T3,T7,sp6启动子载体,表达型载体及各种探针型载体
(pBR322载体:
分子量小、拷贝数高、含四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性核算内切酶仅有一个切割位点
pUC质粒系列:
Puc18/19为代表,以pBR322为基础,去除包括四环素在内的40%DNA,换用了M13噬菌体的一个片段,内含有lacZ的5’序列以表达半乳糖苷酶的α片段,lacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子P和操纵基因O);具有一个改进的pMB1复制子且有很高的拷贝数,保留氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记,双功能检测质粒载体(青霉素抗性基因+蓝白斑筛选)分子量更小;拷贝数更高;多克隆位点MCS由人工合成的多个单一酶切位点构成
5.蓝白斑筛选原理:
pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的序列(α-互补肽)的DNA序列(标记为lacZ’),多克隆位点就存在于lacZ’上;β-半乳糖苷酶的C端编码基因却位于相应的宿主菌上;当这两个部分基因产物(缺陷型-半乳糖苷酶)结合才会形成一个有活性的β-半乳糖苷酶。
这种机制称为α-互补作用。
X-gal是β-半乳糖苷酶的指示剂,在诱导物IPTG(乳糖类似物,效应物)存在下,β-半乳糖苷酶催化X-gal形成蓝色化合物,导致菌落呈现蓝色;而当多克隆位点成功插入目的基因,则lacZ’被破坏,无法合成α-互补肽与宿主合成的相应片段互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶,就无法与底物X-gal发生反应产生蓝色颜色反应,所以对应的菌落应该为白色。
所以基因工程实验中,白色菌落为重组子,蓝色菌落是空载体转化子
6.噬菌体载体:
1)噬菌体分类:
根据与宿主的关系,可分为烈性和温和噬菌体(烈性噬菌体仅有溶菌生长周期;温和噬菌体既能进入溶菌生长周期,又能在感染过程中不产生子代噬菌体颗粒,噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体DNA上,即进入溶源生长周期。
噬菌体载体与质粒载体比较结构更加复杂,但感染细胞更为有效)
2)λ噬菌体是一种温和噬菌体,遗传结构研究比较清楚,且装载量较质粒大,可以用来构建基因文库。
入侵大肠杆菌后可以按裂解或溶源两种方式生存和繁殖(λ噬菌体在宿主内进行独立复制,在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体,并冲破(杀死)细菌释放出来,再度感染其它活菌,称为溶菌λ噬菌体侵入菌体后,把自身DNA加进细菌DNA里(整合),作为细菌基因的一部分,随菌的细胞分裂而增殖,这种生活状态称为溶源
3)热启动:
λ噬菌体从溶原状态转变为裂解状态时一种可诱导过程,实验室常用的是热诱导。
低温时(30℃)建立溶原,高温(42℃)则出现裂解。
λ噬菌体的c1基因是温度敏感突变型的,称为c1ts。
λc1ts可作为组件插入质粒DNA内,目的基因插入在其下游,重组体的目的基因在42℃表达,30℃不表达。
这种方法称为热诱导表达,使用的是温敏开关
4)噬菌体载体分类:
插入型载体和替换型载体(插入型仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点;替换型具有两个对应的酶切克隆位点)
5)λ噬菌体构建:
相较于野生型λ噬菌体DNA,人工构建的DNA缩短了自身的长度,增大了装载量;删除或诱变重复的酶切口,防止重复的酶切口影响后续外源DNA的组装;加装了选择标记,如蓝白斑筛选的lacZ’
6)λDNA作为载体的优点
1).λDNA可在体外包装成噬菌体颗粒,能高效感染大肠杆菌2).λDNA作为载体,其装载外源DNA的能力可达25kb,远远大于质粒的装载量3).它既可作为克隆载体,也可作为表达载体,在基因库筛选中,λ噬菌体作载体与细菌质粒相比,具有易操作、阳性克隆数多等特点,现广泛用于各类基因库的构建
7.柯斯质粒载体<定义>:
柯斯质粒(Cosmid)载体又叫粘粒载体,这是一种由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征,被称为cosmid,指带有粘性末端位点的质粒。
(柯斯质粒在结构组成上具有λ噬菌体的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力,一般可插入35~40kb的外源基因,是构建真核生物基因文库的主要载体)
8.表达载体的特点:
具有克隆载体所具有的基本特性;具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件:
启动子、核糖体结合位点、转录终止序列
9.原核生物表达载体:
①复制子序列,允许其在宿主细胞内自由复制②选择性标记,筛选载体是否进入到受体细胞③多克隆位点,方便目的基因的插入和整合④控制转录的启动子,如Lac、trp、tac启动子及T7、SP6噬菌体启动子,经诱导后能从克隆化基因产生大量mRNA⑤转录调控序列,合适的核糖体结合位点、起始密码ATG和转录终止序列
1)启动子(客观题)
大肠杆菌表达载体中常用的启动子:
(1)trp-lac启动子(又称tac启动子):
tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子,由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD序列融合而成。
受lac阻遏蛋白的抑制,异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达。
(2)噬菌体PL启动子特点:
受温度的控制,低温(37C)下被阻遏而抑制,高温(42C)下去阻遏而激活
(3)T7噬菌体启动子
2)核糖体结合位点(RBS):
RBS由SD序列、核糖体小亚基识别序列和起始密码(ATG)组成,但有时也将SD序列称为核糖体结合位点(SD序列:
存在于原核生物起始密码子AUG上游的一种4-7个核苷酸保守片段,它与16S-rRNA3’端反向互补,所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置便起始翻译作用。
由首次识别其功能意义的科学家Shine-Dalgarno命名)
3)转录终止机制两种依赖ρ因子的转录终止和不依赖ρ因子的转录终止
4)原核表达系统:
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(填空)
5)愿和宿主高效表达策略:
①SD序列与起始密码子的距离②原核序列融合表达(密码子优化)③减轻宿主代谢负担:
生长于表达阶段分开,蛋白分泌
6)E.coli中的高校表达策略
①优化表达载体的设计②优化密码子③提高mRNA的稳定性
4提高目的蛋白的稳定性⑤优化发酵过程
10.真核表达载体:
穿梭载体:
指能在两种不同的生物中复制的载体(通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因,在真核细胞中用于基因表达分析)
1)真核表达优势(与原核比较)大肠杆菌不能表达结构复杂的蛋白质
酵母是单细胞真核生物,可接受质粒转化且具有原核生物生长快、操作简便的特点,又具备哺乳类细胞翻译后加工和修饰的功能;而原核表达如大肠杆菌不能表达结构复杂的蛋白质,不具备真核细胞的翻译后修饰功能,表达得到的蛋白质与目标蛋白存在一定差异。
哺乳细胞、昆虫细胞表达系统能表达结构复杂的细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低
2)启动子:
诱导性中AOX醇氧化酶(最强启动子)和组成型中GAP(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)
3)性结合因子:
MF-α含88个aa,效率高
4)糖基化修饰:
N-糖基化:
天门冬酰胺上的酰胺氮进行糖基化【发挥功能作用】
O-糖基化:
苏/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化(甘露糖)【增加糖蛋白】
5)酵母表达系统:
酿酒酵母,甲醇酵母,克鲁维酵母,汉逊酵母
酿酒酵母:
1安全性2遗传背景清楚3DNA导入方便4易于高密度发酵5翻译后修饰
甲醇毕赤酵母:
1生长迅速2pAOX1强启动子3可诱导表达
6)Mut+:
甲醇利用快型Mut-(既没有AOX1也没有2)Muts(只有AOX2没有1)
7)zeocin筛选(Zeocin是一种属于争光霉素家族的糖蛋白抗生素,在体内能作用于大多数细菌(包括E。
coli)、真菌(如:
酵母菌)、植物细胞、动物细胞、细胞培养级。
)
8)毕赤酵母高效表达策略:
提高转录水平(启动子);信号肽;基因剂量(基因拷贝数);整合位点;发酵条件(培养基成分、pH、溶氧、消泡等);表达产物的稳定性(蛋白酶缺陷菌株、降低pH、竞争性抑制)
11.昆虫表达载体(判断)
Sanger测序法:
蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的
克隆载体T载体
第四章
1.分子克隆:
亦称DNA克隆:
为获得所需的基因或特异序列,需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组,并用适当方法在宿主细胞中表达,扩增得到大量相同的DNA片段。
2.DNA重组:
在转化、转导、转染或转座过程中,整段DNA在细胞内、细胞间或不同物种间进行转移,并发生DNA分子间的共价连接,简称重组。
3.基因文库:
来自某一生物基因组DNA(或来自某一组织所有不同的mRNA的每一种cDNA分子)经酶切所形成的全部DNA片段克隆在细菌中增殖后的集合体或应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆群体。
4.cDNA文库:
将生物某一组织细胞中的总mRNA分离出来作为模板,在体外用反转录酶(ReverseTranscriptase)合成互补的双链DNA(ComplementaryDNA,cDNA),而后接到合适的载体上,导入受体细胞后形成的所有克隆就叫cDNA文库。
5.转化:
将质粒载体DNA分子或其它外源DNA导入感受态原核细胞(大肠杆菌)的过程。
6.转导:
把以噬菌体为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。
7.热激转化:
用化学试剂(如CaCl2处理)制备的感受态细胞,通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞。
8.电激转化:
使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲短暂作用于细胞,将载体DNA分子导入受体细胞,从而显著提高转化效率。
9.感受态细胞:
受体细胞经过一些特殊方法(如:
CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生暂时的变化,成为能容许外源DNA的载体分子通过的的细胞状态,称为感受态细胞。
10.原生质体:
植物细胞通过质壁分离后,和细胞壁分开的那部分细胞物质。
11.农杆菌介导转化:
将含重组Ti质粒载体的农杆菌与受体共培养,使外源基因导入并整合到染色体。
12.分子克隆路线:
13.基因文库的构建过程:
14.cDNA文库构建过程:
15.逆转录过程:
以mRNA为模板逆转录合成cDNA第一条链;合成cDNA第二条链有两种方法:
一是用大肠杆菌的RNaseH切割RNA-DNA杂交分子产生RNA短片段,DNA聚合酶I以RNA短片段为引物合成新的DNA链(置换合成法);二是利用cDNA第一链的3’端出现的发夹环结构,即第一链末端返折为合成cDNA第二条链提供引物(自身引导法)。
16.筛选:
A.表型特征筛选(遗传检测法):
1.抗药性标志选择:
常用的质粒抗性基因有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素——对于带有抗药基因的质粒重组体,可采用插入灭活法进行筛选
2.标志补救(表达产物与营养缺陷互补)——原理:
转化进入的编码外源DNA的基因,能对受体细胞所具突变性状体内起到抑制互补效应,从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。
3.蓝白斑筛选(α—互补)
B.基因水平检测:
1.限制性酶切图谱:
凝胶电泳法筛选——重组质粒分子量比未插入外源DNA片段的质粒空载体要大。
而质粒DNA的电泳迁移率与分子量大小成比例,带有外源DNA插入序列的分子量较大的重组体DNA在凝胶中的迁移速率比空载体质粒DNA慢。
通过分离提取质粒DNA,进行琼脂糖凝胶电泳可检测具外源DNA的重组质粒。
2.PCR法筛选
3.核酸分子杂交:
原位杂交,southern杂交等——从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆,最广泛使用的一种方法是,应用放射性标记的特定的DNA或RNA作探针,进行DNA/DNA或DNA/RNA的原位杂交检测。
即应用放射性标记的探针,原位筛选重组体菌落。
C.免疫学方法筛选
1
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