血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa 膜蛋白大亲水肽段Sj23HD 的抗体IgG 应答模式及其免疫诊断价值.docx
- 文档编号:5909113
- 上传时间:2023-01-02
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:265.39KB
血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa 膜蛋白大亲水肽段Sj23HD 的抗体IgG 应答模式及其免疫诊断价值.docx
《血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa 膜蛋白大亲水肽段Sj23HD 的抗体IgG 应答模式及其免疫诊断价值.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa 膜蛋白大亲水肽段Sj23HD 的抗体IgG 应答模式及其免疫诊断价值.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa膜蛋白大亲水肽段Sj23HD的抗体IgG应答模式及其免疫诊断价值
血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa膜蛋白大亲水肽段(Sj23HD)的抗体IgG应答模式及其免疫诊断价值
张伟§,王玠§,余传信*,宋丽君,殷旭仁,钱春艳,沈双,金一,柯雪丹,姚媛,高玒,许永良,杨静
寄生虫病预防与控制新技术研发室,卫生部寄生虫病预防与控制技术重点实验室,江苏省血吸虫病防治研究所,无锡,214064,中国
[摘要]目的探讨日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白分子大亲水肽段(Sj23HD)的抗体反应模式及重组Sj23HD-HSA用于血吸虫诊断和疗效考核的价值。
方法构建血吸虫尾蚴感染小鼠及家兔模式动物,采集尾蚴感染前,感染后、治愈后各不同时间点小鼠及家兔血清。
以酵母表达的纯重组Sj23HD蛋白为抗原,通过间接ELISA方法,检测感染前、感染后与治愈后不同时间点血吸虫感染小鼠和家兔血清中抗Sj23HD抗体IgG应答水平的动态变化,观察Sj23HD在小鼠及家兔的抗体反应应答模式及其疗效考核潜能。
同时,通过间接ELISA方法,以Sj23HD-HSA融合蛋白分别检测132份血吸虫、30份肝吸虫、10份肺吸虫、以及80份健康人血清样本,观察该重组抗原用于血吸虫病诊断的价值,并将抗可溶性虫卵抗原的抗体应答反应作为对照。
结果血吸虫感染小鼠及家兔体内抗Sj23HD蛋白的抗体反应呈短寿抗体反应应答模式,抗Sj23HD抗体IgG反应随着感染时间的延长呈上升趋势,治愈后的初期继续上升,至治疗后2-4w达到最高水平,随后逐渐下降,至治疗后16周,部分小鼠、家兔的抗体水平可达到阴性阈值,但下降幅度存在个体差异。
抗SEA抗体水平在治疗后有轻度下降的趋势,而未治疗小鼠、家兔血清中抗Sj23HD、SEA的抗体反应均无明显下降。
重组Sj23HD-HSA和SEA检测132
[基金项目]国家自然科学基金(30972581);江苏省自然科学基金(BK2008110);国家重大科技专项(2008ZX10004-011);江苏省卫生厅科技项目(H201066);江苏省血地寄项目(X201115);江苏省预防医学项目(YZ201030);
[作者单位]江苏省血吸虫病防治研究所新技术研究室(无锡214064);
[作者简介]张伟,男,硕士研究生。
研究方向:
寄生虫病免疫诊断
王玠,女,助理研究员。
研究方向:
血吸虫病分子免疫与诊断
*通信作者:
chxnyu@;yangjianliang101@;§为共同第一作者。
份血吸虫病人血清,阳性率分别为88.64%和97.73%;检测10份肺吸虫病人血清,交叉反应率为50%和90%;检测30份肝吸虫病人交叉反应为0%和16%;检测80份健康人血清,均无交叉反应。
结论本研究证明血吸虫感染小鼠、家兔血清中抗Sj23HD蛋白的抗体反应为抗原依赖的短寿抗体反应,检测参与这一特异性短寿抗体反应的抗体具有血吸虫病诊断与疗效考核潜能。
与SEA相比,重组Sj23HD蛋白用于血吸虫病诊断具有较好的特异性,但对于来自肺吸虫流行区的患者仍需注意鉴别诊断。
[关键词]日本血吸虫;23kDa膜蛋白大亲水肽段;短寿抗体反应;免疫诊断;疗效考核
TheantibodyresponsepatternofSj23HDinmiceandrabbitsinfectedwithSchistosomajaponicumandimmunodiagnosticvalue
ZHANGWei§,WANGJie§,YUChuan-xin*,SONGLi-jun,YINXu-ren,QIANChun-yan,SHENShuang,JINGYi,KEXue-dan,YAOYuan,GAOHong,XUYong-liang,YANGJing
DepartmentofNovelBiotechnologyofParasiticDiseasePreventandControl,JiangsuInstituteofParasiticDiseases;KeyLaboratoryonTechnologyforParasiticDiseasePreventionandControl,MinistryofHealth,Wuxi214064,China
*Correspondingauthor,§Theseauthorscontributedequallytothiswork.
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheantibodyresponsepatternofthelargehydrophilicdomanof23kDamembraneproteininmiceandrabbitsinfectedwithSchistosomajaponicum,andobservethevalueofimmunodiagnosisandevaluatingchemotherapeuticeffectoftherecombinantfusionproteinofSj23HD-HSAforschistosomiasisjaponica.MethodsTheseraofmiceandrabbitsinfectedwithSchistosomajaponicumbeforeinfection,duringinfectionandaftercurewithPZQatdifferenttimewereprepared.ToobservetheantibodyresponsepatternofSj23HDinmiceandrabbitsinfectedwithSchistosomajaponicumandthepotentialofevaluatingchemotherapeuticeffectofschistosomiasis,thedynamicsofantibodyresponseagainstSj23HDbeforeinfection,duringinfectionandaftercurewithPZQatdifferenttimeweredetectedbyindirectionEnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA).Meanwhile,toevaluatetheimmunodiagnosticvalueofrecombinantSj23HD-HSA,seraof132schistosomiasis,30clonorchiasis,10paragonimiasis,80healthyweredetectedbyindirectionELISAwithrecombinantSj23HD-HSA.Forexperimentalcontrol,theantibodyIgGagainstsolubleeggantigen(SEA)inserawasdetectedbythesameindirectionELISAinthesametime.ResultsTheantibodyresponseagainstSj23HDrosealongwiththeinfectiondurationextension,andenhancedcontinuallytopeakin2-4wpostPZQtreatment,thendeclinedgradually,thelevelofantibodyresponseofpartialmiceorrabbitsreachedthenegativecutoffvalueat16wPZQposttreatment,butthedeclineextentofantibodyresponseindifferentindividualswasdifferent.TherewasaslightdeclineofantibodyresponseagainstSEAinmiceandrabbitsoftreatedgroup,butnodeclineofantibodyresponseagainstSj23HDandSEAinmiceandrabbitsofuntreatedgroup.ThepositiverateofantibodyIgGagainstSj23HD-HSAorSEAin132schistosomiasisserawas88.64percentor97.73percentrespectively;ThecrossreactionrateofantibodyIgGagainstSj23HD-HSAorSEAin10paragonimiasisserawas50percentor90percentrespectivelyandin30clonorchiasisserawasnaughtpercentor16percentrespectively;NofalsepositiveofantibodyIgGagainstbothSj23HD-HSAandSEAin80healthyserawasfound.ConclusionTheantibodyresponsepatternofSj23HDproteininmiceandrabbitsinfectedwithSchistosomajaponicumisshortedlivedantibodyresponse.ItispotentbydetectingtheantibodyinvolvedinthisshortlivedantibodyresponseagainstSj23HD-HSAfordiagnosisandevaluatingchemotherapeuticeffectofschistosomiasisjaponica.ComparetoSEA,therecombinantSj23HD-HSAismorespecificforschistosomiasisdiagnosis,butforpatientsfromtheendemicareaofparagonimiasis,itisstillneedtopayattentiontodistinguishwithotherparasiticdiseases.
[Keywords]Schistosomajaponicum;Largehydrophilicdomainof23kDamembraneprotein;Shortlivedantibodyresponse;Immunodiagnosis;Evaluationofchemotherapeuticeffect
系列的研究结果表明,日本血吸虫23kDa膜蛋白分子(Sj23)的血清抗体水平与患者体内血吸虫成虫虫荷量呈相关性,检测这一抗原特异性抗体具有高度的特异性,具有血吸虫病诊断与疗效考核潜能[1-2]。
这些研究成果提示血吸虫病患者体内抗Sj23分子抗体IgG的产生是抗原依赖的,抗体水平随体内Sj23含量变化而变化,呈短寿抗体反应特征。
为验证上述设想,本研究在前期采用酵母外分泌表达技术,在制备了纯化的重组日本血吸虫23kDa膜蛋白分子大亲水肽段(Sj23HD)分子的基础上,进一步观察了血吸虫感染模型小鼠及家兔体内治疗与不治疗小鼠体内抗Sj23HD蛋白抗体IgG水平的动态变化,证实了其反应模式为短寿抗体反应,为进一步发展高效的检测参与短寿抗体反应抗体的血吸虫病诊断与疗效考核方法提供了实践依据。
材料与方法
1材料与试剂
1.1实验动物及抗原
体重20~22g6W龄ICR小鼠购自扬州大学医学动物中心;血吸虫感染性钉螺由江苏省血吸虫病防治研究所钉螺室提供;
纯化酵母表达重组日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段(Sj23HD)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白(Sj23HD-HSA)和日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)由本室制备,-80℃保存。
1.2血清标本
血吸虫病人血清来自江西省、湖北省血吸虫病流行区,经SEA-ELISA、DDIA和粪检均为阳性;肝吸虫病人血清来自广西壮族自治区肝吸虫病流行区,经ELISA和粪检证实为阳性;健康人血清来自无锡市血液中心;兔感染前,感染后、治愈后不同时间点血清样本由本室制备,-80℃保存。
1.3试剂
硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane,NC)购自GE公司(美国);脱脂奶粉购自Oxoid公司(英国);预染蛋白分子量标志物购自Fermentas公司(立陶宛);辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG(H+L)购自Genescript公司(美国);辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG(H+L)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(H+L)购自bethyl公司(美国);蒿甲醚片剂购自昆明制药集团股份有限公司;吡喹酮购自Sigma公司(美国);单组分TMB显色底物购自欣博盛生物科技有限公司;SuperSignalWestPico化学发光显色底物购自ThermoScientific(美国)。
2方法
2.1治疗前、后感染小鼠配对血清的制备
将20只6W龄ICR小鼠分为治疗组(A)和对照组(B)两组,编号A1-A10,B1-B10。
A、B两组小鼠在感染前采血。
每只A、B两组小鼠经腹部贴片法人工感染20条日本血吸虫尾蚴。
感染后35d采血,分离血清。
感染后37d,治疗组开始治疗,蒿甲醚300mg/kg/d(含25%甘油和1%聚氧乙烯蓖麻油的溶剂悬浮,配制21mg/mL),喂药体积0.5mL左右(每只35mg左右),连续灌药2次,每天1次;不治疗组不予药物处理。
感染后40d治疗组灌胃吡喹酮,用含2.5%聚氧乙烯蓖麻油的溶剂悬浮吡喹酮,300mg/kg/d,配制21mg/mL,喂药体积0.5mL左右(每只35mg左右),连续灌药2次,每天1次;不治疗组不予药物处理。
治疗后,治疗组和不治疗组同时采血,治疗后前4w内每1w采血一次,随后每2w采血一次,一直采血到治疗后16w。
拉颈处死小鼠,解剖,检查肝脏及肠组织虫卵肉芽肿病变。
用3%的柠檬酸三钠和7%的氯化钠溶液经心脏灌注冲虫,观察感染和治疗效果。
2.2感染小鼠血清中抗Sj23HD蛋白抗体水平动态变化
用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释重组纯化蛋白至10g/mL,以100L/孔包被酶标板,4℃过夜。
然后用PBST缓冲液注满酶标板孔,振荡器振荡30s后拍干,重复3次。
在每孔中加入300L5%脱脂奶粉,37℃孵育60min。
PBST洗涤一次后,分别加入1:
100稀释的小鼠感染前、感染后及治疗后不同时间的配对血清各100L,同时设空白对照,37℃反应60min。
PBST洗涤三次后,每孔加入1:
20000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗100L,37℃,60min。
PBST洗涤三次后,加入TMB底物50L,室温避光显色约5min,加入2MH2S04终止反应。
酶标仪测定每孔A450nm吸光值,观察治疗组和不治疗组小鼠不同时间点血清抗Sj23HD抗体的水平变化。
同时以相同的方法检测小鼠血清中抗SEA的抗体水平作为对照。
2.3感染兔血清中抗Sj23HD蛋白抗体水平动态变化研究
检测过程同2.2,血清来自感染500条尾蚴的6只新西兰大白兔,其中治疗组4只(R1-R6),不治疗对照组2只(RA、RB)。
二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG,工作浓度为1:
10,000。
同时以相同的方法检测小鼠血清中抗SEA的抗体水平作为对照。
2.4Sj23HD-HSA用于日本血吸虫病人诊断效果分析
分别取日本血吸虫病人血清132份,肝吸虫病人血清30份,健康人血清80份,肺吸虫病人血清10份,采用间接ELISA的方法观察重组Sj23HD-HSA融合蛋白检测血吸虫病抗体IgG的敏感性与特异性,同时以SEA检测作为对照。
检测过程同2.2,使用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,工作浓度为1:
10,000。
同时以相同的方法检测小鼠血清中抗SEA的抗体水平作为对照。
结果
1小鼠感染和治疗的效果
治疗后16周,解剖小鼠,通过心脏灌注冲虫。
发现治疗组小鼠肝脏及肠壁没有明显的虫卵肉芽肿病变,心脏灌注未发现成虫,说明治疗很彻底。
图1A。
未治疗对照组小鼠肝脏、肠组织有明显虫卵肉芽肿结节,结节很多,呈肉芽肿病变,腹腔中有大量的腹水。
心脏灌注发现未治疗对照组有4-6对合抱成虫。
图1B。
A治疗组;B未治疗组
ATreatedgroup;BUntreatedgroup
图1治疗组与未治疗组小鼠的肝脏、肠壁病变
Fig.1Pathologicchangesofliverandintestinetissueofmiceoftreatedanduntreatedgroup
2感染小鼠血清中抗Sj23HD抗体IgG水平动态变化
分别以重组Sj23HD-HSA融合蛋白、SEA为抗原,采用间接ELISA的方法同时检测感染前,感染后(治疗前),以及治疗后不同时间点各小鼠血清中的抗Sj23HD和抗SEA抗体IgG动态水平变化。
结果显示,治疗组小鼠血清中抗Sj23HD的抗体IgG水平在治疗后1-2w持续上升,在治疗后2w达到峰值。
但随着治疗后时间的推移呈逐步降低的趋势,到治疗后16w部分小鼠抗体水平已接近阴性临界值,但个体之间存在明显的差异(如图2)。
未治疗对照组小鼠抗Sj23HD的抗体IgG水平随着时间的推移降低不明显(如图3)。
图3未治疗小鼠血清抗Sj23HD抗体IgG水平动态变化
Fig.3Dynamicsofanti-Sj23HDantibodyIgGofuntreatedmice
图2治疗前、后小鼠血清抗Sj23HD抗体IgG水平动态变化
Fig.2Dynamicsofanti-Sj23HDantibodyIgGofmicebeforeandaftertreatment
治疗组小鼠血清中抗SEA抗体IgG水平在治疗后4w达到最高峰,随着治疗时间的推移,虽然有降低的趋势,但仍维持较高的水平(如图4),而未治疗组小鼠血清中抗SEA抗体IgG水平随着时间的推移呈逐渐上升的趋势(如图5)。
图4治疗前、后小鼠血清抗SEA抗体IgG水平动态变化
Fig.4Dynamicsofanti-SEAantibodyIgGmicebeforeandaftertreatment
图5未治疗小鼠血清抗SEA抗体IgG水平动态变化
Fig.5Dynamicsofanti-SEAantibodyIgGofuntreatedmice
3感染兔血清抗Sj23HD抗体IgG水平动态变化
采用间接ELISA方法同时检测感染前,感染后(治疗前)、治疗后不同时间点血吸虫感染兔血清中的抗Sj23HD和抗SEA抗体IgG水平动态变化,结果显示治疗后兔血清中抗Sj23HD的抗体IgG水平随着治疗后时间的推移呈逐渐降低的趋势,但下降的幅度存在个体差异,部分家兔在治疗后16w已达阴性阈值(如图6)。
而未治疗组兔血清中抗Sj23HD的抗体IgG水平随着时间的推移无逐渐降低的趋势(如图7)。
图7未治疗家兔血清中抗Sj23HD抗体IgG
水平动态变化
Fig.7Dynamicsofanti-Sj23HDantibodyIgGof
untreatedrabbits
图6治疗前、后家兔血清抗Sj23HD抗体IgG
水平动态变化
Fig.6Dynamicsofanti-Sj23HDantibodyIgGof
rabbitsbeforeandaftertreatment
治疗组和未治疗组家兔血清抗SEA抗体IgG水平随着治疗后时间的推移,在观察时间内均未出现逐渐降低的趋势。
图8,9。
图8治疗前、后家兔血清抗SEA抗体IgG
水平动态变化
Fig.8Dynamicsofanti-SEAantibodyIgG
ofrabbitsbeforeandaftertreatment
图9未治疗兔子血清中抗SEA抗体IgG
水平动态变化
Fig.9Dynamicsofanti-SEAantibodyIgG
ofuntreatedrabbits
4重组Sj23HD-HSA融合蛋白的日本血吸虫病人诊断效果分析
以Sj23HD-HSA为检测抗原,以阴性对照平均吸光值的2.1倍值为阳性判断阈值,采用间接ELISA检测132份血吸虫病人血清,阳性率达88.64%;检测30份肝吸虫病人血清,交叉反应率为0%;检测10份肺吸虫病人血清,交叉反应率为50%;检测80份健康人血清,假阳性率为0%。
同时,以SEA为检测抗原,以相同的方法检测132份血吸虫病人血清,阳性率达97.73%;检测30份肝吸虫病人血清,交叉反应率为16%;检测10份肺吸虫病人血清,交叉反应率为90%;检测80份健康人血清,假阳性率为0%。
表1。
表1重组Sj23HD-HSA和SEA检测病人血清抗体IgG效果的比较
血清
Serum
例数
No.
Sj23HD-HSAELISA
SEA-ELISA
阳性
Positive
阴性
Negtive
阳性率(%)
Positiverate
阳性
Positive
阴性
Negtive
阳性率(%)
Positiverate
血吸虫病人
132
117
15
88.64
129
3
97.73
肝吸虫病人
30
0
32
0
5
25
16.67
肺吸虫病人
10
5
5
50
9
1
90
健康人
80
0
80
0
0
80
0
讨论
早在80年代,Cruise[1]和Mitchell[2]等通过基于针对日本血吸虫菲律宾株23kDa膜蛋白分子的单抗I-134的竞争抑制放射免疫试验及酶联免疫试验证实了23kDa膜蛋白分子具有血吸虫病诊断价值与疗效考核潜能。
这些研究结果显示的抗日本血吸虫23kDa膜蛋白分子抗体IgG水平与患者体内血吸虫成虫的虫荷量呈相关性,体内虫荷量大,则血清中抗Sj23kDa膜蛋白抗体IgG水平高,反之,患者
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 血吸虫感染小鼠及家兔抗Sj23kDa 膜蛋白大亲水肽段Sj23HD 的抗体IgG 应答模式及其免疫诊断价值 血吸虫 感染
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)
链接地址:https://www.bdocx.com/doc/5909113.html