酵母菌高密度发酵.docx

酵母菌高密度发酵.docx

《酵母菌高密度发酵.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母菌高密度发酵.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酵母菌高密度发酵

课程设计

课程名称：

发酵工程

设计题目：

酵母菌高密度发酵

院系：

生物与食品工程学院

学生姓名：

******

学号：

************

专业班级：

10生物工程

（2）班

指导教师：

******

2013年5月24日

课程设计任务书

设计题目

酵母菌高密度发酵

学生姓名

所在院系

生物与食品工程学院

专业、年级、班

10生物工程

（2）班

设计要求：

1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。

2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。

3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。

4、设计标准要求规范、实用、切合实际。

5、设计应严格按有关设计规范进行。

6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。

学生应完成的工作：

1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。

2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。

3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。

新方法需经多试验或单一实验法验证。

4、给出检验规则。

5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。

参考文献阅读：

[1]张琴.酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状[J].浙江化工,2011,42

（2）:

11-15.

[2]熊子书.中国酿酒酵母菌的研究[J].酿酒科技,2002,4:

23-26.

工作计划：

2013.5.27----2013.5.30接受设计任务，查阅相关文献。

2013.5.30----2013.6.3整理文献资料，进行产品标准的应用设计。

2013.6.3—2013.6.9整理设计内容，完成课程设计报告。

任务下达日期：

2013年5月13日

任务完成日期：

2013年5月24日

指导教师（签名）：

学生（签名）：

酵母菌高密度发酵

摘要：

分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的微生物培养方法。

补料分批培养则是在培养过程中间歇或连续的添加新鲜培养基。

本次实验分别通过补料分批培养与分批培养，测定相应的pH值、溶氧量、生物量、残糖量等，并比较分批培养和分批补料培养酵母细胞发酵过程的过程规律，从而达到优化酵母的发酵过程的目的。

关键词：

高密度发酵；补料分批培养；酵母发酵过程

1.设计背景…………………………………………………………1

2设计方案……………………………………………………………1

2.1分批发酵…………………………………………………………2

2.2补料分批发酵……………………………………………………2

3.实施方案……………………………………………………………3

3.1材料与方法………………………………………………………3

3.1.2菌种…………………………………………………………3

3.1.3培养基………………………………………………………3

3.1.4仪器与设备…………………………………………………3

3.1.5试剂………………………………………………………3

3.2培养基配制、分装和灭菌………………………………3

3.2.1配制PDA培养基…………………………………………3

3.2.2发酵罐培养基分装及灭菌…………………………………4

3.2.3玻璃器皿包装及灭菌……………………………………4

3.2.4种子液的制备…………………………………………4

3.2.5接种……………………………………………………4

3.2.6实时监测pH和溶氧量…………………………………4

3.2.7补料……………………………………………………4

3.3酿酒酵母发酵液残糖量测定………………………………4

3.4残糖量测定………………………………………5

3.5酿酒酵母发酵液生物量的测定…………………………5

4.结果与讨论…………………………………………………6

5.

4.1结果与讨论分析…………………………………………6

5.收获与致谢…………………………………………………8

6参考文献…………………………………………………9

1.设计背景

酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。

酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。

可在缺氧环境中生存。

目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母分成三类：

形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。

不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。

目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。

酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，而在酿酒中，它也十分重要。

酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。

在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成二氧化碳和乙醇（俗称酒精）来获取能量。

在有氧气的环境中，酵母菌将葡萄糖转化为水和二氧化碳。

无氧的条件下，将葡萄糖分解为二氧化碳和酒精。

酵母菌的遗传物质组成：

细胞核DNA，线粒体DNA，以及特殊的质粒DNA。

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。

酵母菌的生殖方式分无性繁殖和有性繁殖两大类。

无性繁殖包括：

芽殖，裂殖，芽裂。

有性繁殖方式:

子囊孢子

酵母菌为单细胞微生物，属真菌类。

从酵母菌分类系统来讲属于真酵母属。

酿酒酵母具有安全性好，高产量和高的抑制剂耐受性等优点，故一直在生物乙醇工业中有重要作用。

通常以出芽繁殖。

繁殖速度较霉菌快，与原生动物不同，有坚韧的细胞壁，菌体比细菌大且形态复杂。

繁殖时有的能进行二等份分裂，有的种类能产生于囊孢子。

其形态因培养基种类及培养时间的长短而异，分别为圆形、卵形、椭圆形或腊肠形等，内有细胞核、液泡和颗粒物质。

酵母菌在自然界分布甚广，为发酵工业酿酒酵母为兼性厌氧型微生物，利用酵母菌发酵生产工业乙醇具有辽阔的应用前景。

发酵培养基是酿酒酵母营养和能量的来源，其组分在发酵过程中无疑起着更为关键的作用。

从普通酿酒酵母菌株的营养条件出发进行研究，在其他的条件均相同的情况下，通过分批培养与补料分批培养（补料分批培养在培养至残糖量最低时进行补料）培养相同的普通酵母菌株。

由于在分批培养中菌体生长无法控制，容易有副产物形成，因而影响发酵产率。

补料培养在有效地利用原料、减少副产物、提高产物生产水平方面均有显著的效果，而且也是生产中比较切实可行的方法。

通过发酵培养过程中得到的pH值、溶氧量、生物量、残糖量等数据，进行处理与分析，以期得到优化酿酒酵母发酵过程的方法。

2.设计方案

2.1分批发酵

将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养14h，调节通气量为3L/min。

从发酵开始，每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。

2.2补料分批发酵

将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养14h，调节通气量为3L/min。

在细胞生长的对数生长期中后期一次性添加20g葡萄糖到发酵罐中。

每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。

下面是发酵过程简要技术路线的图

发酵罐的安装与清洗

种子的活化

配制培养基

分批补料培养

酵母菌的扩大培养

发酵罐的培养

发酵终点的判断

3.方案实施

3.1材料与方法

3.1.2菌种

实验室自备的酿酒酵母

3.1.3培养基

PDA（斜面、平板培养基）：

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。

制法：

马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热溶化后在补足水分至1000ml，121℃灭菌20min。

种子培养基（YEPD培养基）：

酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。

发酵培养基：

YEPD培养基。

酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。

3.1.4仪器与设备

发酵罐、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管架、电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，试管，玻璃棒，培养皿，移液管、注射器（取样用）、离心管等。

3.1.5试剂

3，5-二硝基水杨酸等。

方法

3.2培养基配制、分装和灭菌

3.2.1配制PDA培养基，121℃灭菌20min，倒无菌平板活化菌种。

配制YEPD培养基，并进行分装灭菌。

10ml培养基分装到50ml三角瓶中（培养一级种子），20ml培养基分装到100ml三角瓶中，（培养二级种子，作为分批培养种子液）。

20ml培养基分装到100ml三角瓶中，（培养二级种子，作为补料分批培养种子液）。

121℃灭菌20min。

3.2.2发酵罐培养基分装及灭菌

将发酵罐中加入2000ml培养基，盖好盖子，pH电极、溶氧电极等经校正后插入发酵罐中，取样口、进气口用牛皮纸扎好，用夹子把每个直通液面以下的管子夹紧，121℃灭菌20min。

3.2.3玻璃器皿包装及灭菌

将培养皿、移液管包装好121℃灭菌20min。

3.2.4种子液的制备

自斜面菌种挑取酵母菌体，接入装有10ml培养基的50ml三角瓶中，30℃，180r/min培养18h。

将上述培养好的种子液分别接入两个装有20ml培养基的100ml三角瓶中，接种量10%，30℃，180r/min培养18h。

3.2.5接种

将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养48h，调节通气量为3L/min。

3.2.6实时监测pH和溶氧量

从发酵开始，每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。

3.2.7补料

在细胞生长的对数生长期中后期一次性添加20g葡萄糖到发酵罐中。

3.3酿酒酵母发酵液残糖量测定

葡萄糖标准曲线的测定：

DNS法

3,5-二硝基水杨酸试剂：

甲液：

溶解6.9g结晶酚于15.2ml10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。

乙液：

称取255g酒石酸钾钠加到300ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5二硝基水杨酸溶液。

将甲乙二溶液混合既得黄色试剂，储于棕色瓶中备用。

在室温放置7-10天以后使用。

葡萄糖标准溶液的配制：

准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。

浓度为1mg/ml。

取9支25mm×250mm的试管，分别按下表加入试剂：

将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。

于520nm波长处测A值。

以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.4残糖量测定

发酵过程中每隔2h取出10ml发酵液测定残糖量。

取样时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h。

3.5酿酒酵母发酵液生物量的测定

生物量测定（重量法）

发酵过程中每隔2h取出10ml发酵液，3000r/min离心10min,弃上清液，湿菌泥在80℃下干燥24h后称量，测定生物量。

取样时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14等。

4.结果与结论

表一：

大肠杆菌实验记录表

表二：

大肠杆菌OD值折线图

4.1结果与分析与讨论

补料分批培养pH的比较分析：

由数据和图表可以看出，补料分批培养的pH值是先降，在8h时有些微上升，而后又开始下降，而后又开始上升，但总的趋势是下降然后上升，造成区别的原因是补料分批培养在6h时有补料，所以菌体又开始利用新的碳源。

残糖量是先下降再趋于平稳，并且最后在0坐标附近，变化趋势类似，但在6h时（即补料分批培养的补料点，通过分批培养的图可知，此时残糖量降到低点，且菌体应该生长到了对数期），

在生物量方面，补料分批培养的生物量的趋势线比较杂乱，但也可以看出是在曲折上升，并且生物量最高值为4.5g/L。

补料分批培养比较有利于酿酒酵母的发酵和生长。

同时也可以进一步优化补料分批培养的培养条件，如流加限制性底物而不要一次性添加，控制酵母发酵时的pH值，因为另外pH的降低也会造成酸损伤，调整最适合酿酒酵母发酵的温度，因为温度越低，发酵启动越慢，在同等温度条件下，各菌株表现较为接近。

经数据统计汇总分析，酵母菌生长折线由先前的平缓曲线到后来的陡然上升直到稳定峰值，最后衰减。

整个生长历程符合菌体的生长曲线。

由先前的适应期到随后的对数期，进入稳定期直到衰亡期。

整个实验较为成功.

5.收获与致谢

首先感谢老师们为我们提供了发酵实训实验，时间虽短，却让我们切身体会到发酵的实际操作过程。

期间需要大家认真的态度，做到分工明确，有条不紊、忙中不乱，通过大家的共同努力，协调一致的做好岗位工作，才能做得好、做得细、做得全。

尤其是守夜的同学，他们这种精神值得我们学习。

一个感触——不容易：

绝知此事要躬行。

一种意识——安全：

无论我们以后从事什么工作，要始终有一种意识，那就是把安全放在第一位。

一种态度——责任：

没有负责人的态度，终将一事无成。

6.参考文献

[1]张琴.酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状[J].浙江化工,2011,42

（2）:

11-15.

[2]熊子书.中国酿酒酵母菌的研究[J].酿酒科技,2002,4:

23-26.

[3]邢建字,杨莉.培养基中各营养组分对酿酒酵母发酵的影响[J].食品研究与开发,2011,32

（2）:

139-142.

指导教师评语：

课程设计报告成绩：

，占总成绩比例：

课程设计其它环节成绩：

环节名称：

，成绩：

，占总成绩比例：

环节名称：

，成绩：

，占总成绩比例：

环节名称：

，成绩：

，占总成绩比例：

总成绩：

指导教师签字：

年月日

本次课程设计负责人意见：

负责人签字：

年月日