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正文
核酶抗肿瘤和抗病毒作用的研究进展
摘要
酶大多数是蛋白质,也有少数具有生物催化活性的大分子,比如RNA、DNA。
而核酶(Ribozyme,Rz)就是一类具有生物催化活性的RNA。
底物是RNA分子的核酶,可催化底物分子RNA的切割和剪接。
其作用特点是:
切割效率低,易被RNase破坏。
催化类型包括RNA的转核苷酰反应、RNA限制性内切酶的反应(水解反应)和聚合酶活性反应(连接反应)等;还可能具有氨基酸酯酶、氨基酰tRNA合成酶和肽基转移酶的活性,表明核酶在翻译过程中和核糖体发挥功能中起着重要的作用。
目前发现的核酶包括有:
Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子、RNaseP、锤头状,发夹状、斧头状核酶(丁型肝炎病毒核酶)。
近些年的研究证实,核酶普遍存在于自然界,其二级结构是由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环、TφC环五部分组成。
核酶是催化剂,可以被反复利用,因此与反义RNA相比,核酶药物使用剂量较少,作用大,毒性也较小,而且核酶对病毒作用的靶向序列是专一的,因此病毒较难产生耐受性。
利用核酶剪接作用的高度专一性治疗相应疾病具有长远的应用前景。
目前,核酶技术是一种很有应用前景的基因治疗手段,尽管在20年里有了巨大的发展,但还有许多问题没有解决,如体外筛选活性高的核酶,加强对发荚状(Hairpinribozyme)、斧头状核酶(Theaxeofribozyme)的研究,建立体内高效表达系统,增强核酶在细胞内的切割效率、寻求更加有效的载体等。
这些问题的解决,使核酶在临床应用的时间进一步缩短。
目前虽然核酶的抗肿瘤和抗病毒作用还处于实验研究阶段,但已经露出了希望的曙光。
这篇文章就近几年来核酶在抗肿瘤和抗病毒作用治疗中的应用进行简要概述。
关键词:
核酶;抗肿瘤;抗病毒
Theresearchprogressofribozymesantitumorandantiviraleffect
Author:
WangRuanna
Tutror:
LiHongming
Abstract
RibozymeisacatalyticRNAhavingabiologicalactivity.TheribozymesubstrateisaRNAmolecule,whichcatalyzetheRNAcuttingandsplicing.Itsfunctioncharacteristicsare:
lowcuttingefficiency,easytodamagebyRNase;catalytictypesincludeRNAnucleotidylacylreaction,hydrolysisreaction(RNArestrictionendonucleasereaction)andconnectionreaction(polymeraseactivity);alsomayhaveaminoacidesterase,aminoacyltRNAsynthetaseandpeptidyltransferaseactivity,showedthatribozymeplayplaysanimportantroleinTranslationprocessandribosomefunction.Currentlyfoundintheribozymeincludes:
aclassofintron,introntwoclass,RNaseP,hammerhead,hairpin,axeheadribozyme(HDVribozyme).Inrecentyears,confirmed,ribozymeexistswidelyinnature,itssecondarystructurehasbeenstudiedclearly.Ribozymeisthecatalystthatcanberepeatedaction,comparedwithantisenseRNA,ribozymeslessmedicationdosage,toxicityisalsosmaller,andtheroleofthevirusribozymetargetingsequenceisspecific,andthereforemoredifficulttoproducevirustolerance.Splicingribozymeuseofhighlyspecificdiseasestreatmentcorrespondingapplication.Ribozymetechnologyasapromisingtoolingenetherapy,although20yearshavehadgreatdevelopment,buttherearemanyproblemsremaintobesolved,suchastheribozymeinvitroscreeningofhighactivity,strengthentheresearchonlenticular,axeribozymesinvivoexpressionsystem,theestablishmentofefficient,enhanceribozymewithincells.Thecuttingefficiency,seekmoreeffectivevectorsetc.Tosolvetheseproblems,willundoubtedlymaketheribozymetofurthershortenthetimeinclinicalapplication.Althoughtheribozymeantiviral,antitumoreffectsareintheexperimentalstage,buthasbeenexposedtothedawnofhope.Withthefurtherglobalscienceandtechnologyworkersefforts,theanti-tumortherapyribozymeantiviral,certainlywillhavebrilliantprospects.Articlesonrecentyearsribozymeusedinanti-viralandanti-tumortherapybriefly.
Keywords:
ribozyme;anti-virus;anti-tumor
目录
1前言1
2核酶在抗肿瘤中的作用1
2.1抗肿瘤血管形成靶向治疗1
2.2核酶抑制端粒酶活性1
2.3核酶抗肿瘤增殖2
2.4核酶抗多药耐药2
2.5其他作用3
3核酶在抗病毒中的作用3
3.1抗乙型肝炎(HBV)病毒3
3.2抗慢性丙型肝炎(HCV)病毒4
3.3抗丁型肝炎(HDV)病毒4
3.4核酶抗人类免疫缺陷病(HIV)病毒5
3.5核酶在植物抗病毒的研究6
3.6其它作用7
结论8
致谢9
参考文献10
1前言
核酶(Ribozyme,Rz)是一类独特的RNA分子,具有锤头状(Hammerheadshape)、发夹状(Hairpin)和斧头状(Theaxeshape)三种基本结构。
锤头状是核酶最简单的二级结构。
现在人们已成功地设计并合成了具有自我剪切和催化功能的核酶。
核酶具有序列特异性,没有免疫活性是因为不编码蛋白,又可以反复被利用等优点。
目前已经广泛应用于基因治疗领域。
人工设计的催化分子间反应的核酶是根据催化分子内自我剪切的核酶所得出来的,并能够在固定点切割酶的靶序列。
核酶自身的主要功能特点和阻断基因表达的主要依据是特异性切割RNA。
这一点为控制有害基因如病毒基因、癌基因的表达提供了新的研究方案。
现在本文将核酶在这一方面的研究应用进展作简要概述。
2核酶在抗肿瘤中的作用
2.1核酶抑制血管形成靶向治疗
核酶(Ribozyme,Rz)是一类具有生物催化活性的RNA分子。
有效地阻断特定基因的表达,发挥其生物学功能是因为核酶能够在固定点处切割特定的mRNA分子。
Czubayko等[1]人工合成了针对多效因子(pleiotrophin,PTN)的核酶,并将这个多效因子转染到能高度表达PTN的人黑色素细胞系。
研究结果显示,PTNRz使转染细胞PTN的水平降低。
虽然在体外试验中,黑色素瘤细胞的生长并没有因为PTN的降低而受到抑制,但在裸鼠试验中证实,PTN的降低确实遏止了肿瘤生长和新生血管生成,增加了肿瘤细胞的凋亡,并且使肿瘤的转移得到了抑制。
Pavco等[2]设计的mRNA是利用化学性质稳定的核酶特异性剪接VEGF受体(VEGFR-1,VEGFR-2)而得出的,使裸鼠结肠癌转移的发生得到了明显的抑制。
该研究结果发现,利用人工合成核酶治疗大肠癌是一个新的途径则。
作为作用于VEGF受体mRNA的一种核酶Angiozyme,通过分解VEGF的Flt-1受体而发挥作用是它的主要作用机制,并且没有明显的毒性作用。
现在Angiozyme核酶正在进行恶性肿瘤晚期的临床研究,初步显示Angiozyme的耐受性较好,且有较小的毒性反应。
2.2核酶抑制端粒酶活性
端粒酶(telomerase)是一种由蛋白和RNA两部分组分构成的核蛋白复合物(Nucleoproteincomplexes)。
在细胞分裂时,它以人自身端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)组分为模板,催化合成染色体顶端端粒酶的顺序,找回端粒酶丢失的部分,从而使细胞得到永生化。
恶性肿瘤的形成和发展与端粒酶的激活有密切的联系。
研究结果表明,端粒酶RNA组分的表达以及端粒酶活性会随着肿瘤细胞诱导分化的降低而减弱。
这使得人们对肿瘤细胞失去永生化能力产生浓厚的兴趣,肿瘤细胞失去永生化是通过抑制端粒酶活性来实现的,而抑制端粒酶活性是由减少hTR组分实现的。
Yokoyama等设计了靶向hTR35、170、315位的锤头状核酶(Hammerheadshaperibozyme)。
在细胞外体系中,该锤头状核酶能够有效的切割RNA底物。
在1-Shikawa细胞系(一种子宫内膜瘤细胞)中,有一种核酶能够抑制端粒酶活性,方法是将该核酶克隆到载体并使其表达,进而导入到另一子宫内膜瘤细胞株AN3CA中,以此来降低端粒酶的活性、RNA水平[3]。
2002年,国内学者屈艺等[4]在hTERTmRNA2239bp处设计了一个核酶,该核酶的结构是锤头状,并将其转导入到人宫颈癌细胞和人肝癌细胞中。
结果发现端粒酶活性有显著的降低,并加速了细胞的凋亡。
2.3核酶抗肿瘤增殖
ras基因家族是由H-ras、K-ras和N-ras三种基因组成。
研究结果已经证实在细胞发育和肿瘤发生中起重要作用的是ras基因家族成员。
肿瘤可以使ras基因家族中的基因发生突变,这一突变会使GTP的结构在结合位点处也发生变化。
虽然突变型的ras基因表达出来的蛋白仍然保持其催化活性,但降低了水解GTP的能力,因而会自主地激发细胞的生长、分化。
因此,特异性抑制ras癌基因的突变是基因治疗抗肿瘤的一项重要方法。
核酶的序列能够靶向且特异性抑制mRNA,故能够把正常ras基因和突变ras基因区别开来。
根据这个结果的显示,Irie等[5]在1999年设计出了一种针对ras癌基因突变的锤头状核酶,他们做的实验是该锤头状核酶在体外及裸鼠体内观察对膀胱癌的治疗作用,其结果明显使肿瘤的生长得到了抑制,并且两者呈效量关系。
Tsuchida[6]和Kijima等[7]设计出针对K-ras基因的第12位密码子结构为锤头状的核酶,经过腺病毒得介导转染到胰腺癌的Capan-1细胞株,这样可以抑制该癌细胞的增殖,逆转其恶性表现型,得到控制癌基因扩散的结果。
在此之后,Zhang[8]也设计出了针对K-ras基因的第12位密码子的锤头状核酶,该实验是在体外及动物模型内观察此锤头状核酶对肺癌非小细胞的治疗作用。
研究结果显示,此人工合成的核酶比单纯反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotidesnucleotides)治疗更为有效。
2.4核酶抗多药耐药
多药耐药[9](multidrugresistance,MDR)是指肿瘤细胞对化疗药物的原发性(Primary)或继发性(Secondary)的抵抗现象。
肿瘤细胞MDR-1基因的扩增是它产生的机制之一,它编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)与多药耐药相关蛋白(multidrugresistanceprotein,MRP)会将胞浆内针对它的化疗药物排到细胞间隙中,使胞浆内的化疗药物浓度下降。
肿瘤患者对化疗的敏感性增加是由于P-gp的过度表达,但是许多肿瘤患者在化疗以前就有了MDR-1基因的高度表达,即肿瘤的原发性耐药(Primarydrugresistance)或内在性耐药(intrinsicresistance),且在化疗后的比例会变得更高。
因此许多学者应用反义单核苷酸切割技术来控制P-gp蛋白的表达,改善肿瘤患者在化疗后期的治疗。
Gao等[10]在体外经转录酶合成了针对MDR-1基因的锤头状核酶,在克隆人细胞逆转录病毒载体pCEAMR中,转染结肠癌细胞株SW1116R。
产生CEA的该细胞株,可以对阿霉素有抵抗作用并抑制MDR基因的表达。
作者发现在细胞中这种锤头状核酶可以稳定的表达,并且抑制MDR-1mRNA基因的表达以及P-gp的水平明显降低。
该细胞对阿霉素(adriamycin)的抗药性下降了93.1%。
Holm选用密码子880处的GUC三联体并且设置37端为切点,设计了针对MDR-1mRNA的锤头状核酶,实验结果证明实了MDR-1mRNA核酶在细胞间隙中也能够有效地、特异性地在GUC处切割MDR-1基因。
应用哺乳动物表达载体PHbetaApr-1neo将Rz基因导入胰腺癌细胞株EPP85-181RDB中,可以抑制P-gP的生成,明显减少了EPP85-181RDB对柔红霉素的抗药性。
MDR的产生与c-fos癌基因的表达增加有关。
Scanlon将切割c-fosmRNA的核酶质粒转染到人类卵巢癌细胞株A2780AD中,结果是该A2780AD细胞株对放线菌素D有抗药性,并伴有MDR的表现型。
发现抗fosmRNA的核酶可以使c-fos的表达减弱,同时降低了MDR-1基因、c-jun基因、突变型p53基因的水平,并使对化疗药物的敏感作用得到恢复。
这个结果也进一步证实了c-fos基因在药物抗药性方面起重要作用是通过参与信号转导的途径而实现的。
2.5其它作用
随着现在许多医疗技术人员对更多细胞因子和蛋白的研究进展,人们开始重视其他蛋白因子对肿瘤血管生成的影响,并将对核酶的研究也在其中体现[11]。
Abounader等[12]的研究显示,将U1snRNA/ribozymes用于神经胶质瘤的治疗,可抑制肿瘤的生长、增殖以及使肿瘤SF/HGF和c-met基因的表达水平降低。
对用U1snRNA/ribozymes处理后的肿瘤细胞进行组织学检查。
结果表明,血管的密度显著降低,也增加了肿瘤细胞的凋亡。
将带有抗SF/HGF和抗c-met基因的U1snRNA/ribozymes的腺病毒载体经肿瘤细胞注射到颅内移植有神经胶质瘤的动物体内,结果可充分抑制肿瘤的生长及增殖,使动物存活率升高。
如果想要达到同样的效果也可以静脉注射U1snRNA/ribozyme脂质体复合物。
Jiang等[13]针对人HGF/SF受体(pLXSN-MET)或HGF/SF受体(pLXSN-HGF)的核酶基因建立了含有编码特异性逆转录病毒载体。
并用这一载体分别转染到裸鼠乳腺癌模型肿瘤细胞MDAMD231和成纤维细胞株的MRC5细胞中。
实验结果证明,人工特异性合成针对HGF/SF及其受体的核酶可以减少乳腺癌细胞的生长、增殖,同时通过抑制肿瘤细胞在细胞间质分泌物的相互作用来减弱肿瘤细胞对血管生成的控制。
低氧诱导因子-Iα(HIF-Iα)可在快速生长的肿瘤中特异性表达,通过上调某些糖酵解酶、亚型糖酵解蛋白的表达活性,并增加葡萄糖的转运载体和转运蛋白质的活化,从而使肿瘤细胞的无氧代谢增加,继而增加胞膜药物外排的能力、红细胞生成以及血管生成的相关基因的表达,使局部缺血缺氧的肿瘤细胞免于死亡并维持增殖[14]。
3核酶在抗病毒中的作用
3.1抗乙型肝炎(HBV)病毒
乙型肝炎病毒(Hepatitisbvirus,HBV)是引起乙型肝炎的病原体(Pathogens)。
在我国HBV感染率高达10%,然而传统的抗乙型肝炎病毒药物远期的治疗效果都不太明显,现在迫切需要寻找新型抗HBV的药物。
截止到目前,人们发现的核酶共有六种类型:
即I类内含子、Ⅱ类内含子、RNaseP、锤头状核酶(Hammerheadshaperibozymes)、发夹状核酶(Hairpinribozymes)和丁型肝炎病毒核酶(斧头状核酶:
Theaxeofribozymes)。
通过对这六种核酶的组成及结构的深入研究,研究人员已经逐步开始利用锤头状、发夹状核酶的性状及特点,人工合成研究人员自己所需要的核酶。
Weizsacker[15]、汤华[16]、竺来发等人[17]所设计的针对HBV的核酶,均采用传统的方式而制得的。
Hseih等[18]则研究抗HBV的核酶对乙型肝炎病毒的阻断作用。
在血清和细胞内含有大量的核酸酶,这可能导致体内表达的核酶被降解。
因此,现在的大多数研究在于提高体外合成核酶的稳定性。
在体外许多研究人员为了增加核酶的稳定性而针对2-OH进行有目的的修饰。
一些研究通过装在tRNA反密码环或在核酶末端引入茎环结构来提高核酶在细胞内的稳定性。
连建奇发现一种有效的方法来提高核酶在细胞内的稳定性,就是在核酶两端设计顺式核酶[19]。
3.2抗慢性丙型肝炎病毒(HCV)
慢性丙型肝炎病毒(Chronichepatitiscvirus,HCV)是正链RNA病毒。
此病毒是导致慢性肝炎病发的主要原因。
目前干扰素a及利巴韦林来治疗HCV,通常联合治疗效果更佳[21]。
高度变异性是HCV的特性之一,因此对抗HCV药物的研制面临着巨大的挑战。
一些有潜力的抗HCV药物目前正在研制中,如蛋白酶抑制剂,但此抑制剂存在一个无法避免的缺陷,即病毒能够对该抑制剂产生耐药性。
为了防止病毒突变而产生的耐药性,Welch等将多个高度保守HCV的正链RNA和负链RNA序列置于腺病毒载体或腺病毒相关载体上,同时制得了多种抗HCV的核酶。
体外实验研究表明,核酶能够使正链RNA和负链RNA序列得到降解。
3.3抗丁型肝炎(HDV)病毒
丁型肝炎病毒(Hepatitisbvirus,HDV)为一个缺陷性环状负链RNA病毒,含有长约1.7kb的基因组。
其中两条基因组可以自我分裂,这两条基因组分别是基因链和抗基因链。
目前的研究认为,在基因链上的760-715d、726-731、762-766位的核苷酸形成一个二级结构,其形状为斧头状。
与抗基因链结构自裂有关的是位于抗基因链上的80-84、862-871、897-902位的核苷酸结构。
Branch的研究发现,抗HDV的斧头状核酶能够对异体靶细胞RNA进行切割,且具有较高的切割效率[21]。
Roy等(1997年)通过计算机辅助二级结构预测和RNase敏感性分析来确定HDVmRNA上潜在的切割位点,由此得到的核酶选择性地抑制HDV的复制并在靶位点处构建delta。
人工构建的delta核酶在体外以不同的底物进行检验它的切割活性,切割效率最高的核酶可在体内将用于试验的研究[22]。
Roy等(1998年)又进行了delta核酶切割野生型(Wildetype)和突变型(Mutanttype)HDV的研究,其结果显示:
(1)delta核酶可以被多次利用,即多个HDVmRNA分子可以被一个核酶分子连续切割。
(2)核酶并不是只在C/UGN6(一段HDVmRNA序列)处有切割活性,delta核酶切割在切割位点上游含有高鸟苷酸残基的底物更容易比切割野生株底物。
所以,Roy认为delta核酶作为一个具有催化活性的RNA,可进一步用于基因治疗研究[23]。
HDV-RNA自身切割活性与其复制有关,Chen等(1997年)认为抑制HDV的复制可通过抑制HDV基因的核酶活性来达到效果。
氨基苷(aminoglycosides)是一类对HDV核酶活性起很强的抑制作用的抗生素,它用于抗HDV的治疗是很有希望的[24]。
3.4核酶抗人类免疫缺陷病(HIV)病毒
人类免疫缺陷病(HIV)的治疗具有很大挑战性的原因,是由于HIV致病机制的复杂性以及HIV基因的高度变异性决定的,而核酶为治疗HIV提供了一种新的基因治疗方案。
在20世纪90年代初,人们发现核酶在细胞中对抑制HIV-1的繁殖具有有效性,基因治疗研究就是从那时侯开始的。
目前,核酶治疗HIV-1感染已经进入了人类临床试验阶段。
人类免疫缺陷病(HIV)病毒是RNA病毒,根据HIV基因组的基本结构,人们成功地设计了针对所有HIV-1不同结构的RNA核酶,并成功介导进入核酶基因,转入CD4+细胞或细胞株的基因治疗,并且取得了显著的效果。
MedinaMF等用一种特殊的接头酶把一种锤头状核酶和人类tRNA3,端赖氨酸的反密码环相连起来;核酶以HIV-1env基因的编码区作为作用点,并将tRNA转导入人CD4+T细胞系是通过逆转录病毒载体而实现的。
研究结果表明,核酶抑制HIV-l的复制得到了极大的提高[25]。
KlebbaC等人工设计的核酶转导入感染HIV-1的人CD4+T细胞和Hut78细胞是经逆转录病毒载体来完成的,结果也表明核酶抑制上述两种细胞所感染的HIV-1基因的复制[26]。
目前已经有多项应用核酶技术的HIV基因治疗策略获准进入临床I期实验研究并取得了令人兴奋的成果。
Wong-StealF等用核酶转导入HIV-1感染者自己体内淋巴细胞,以切割HIV-1RNA为目标,从而该核酶的活性抑制了肿瘤细胞的增殖。
初期实验结果表明,经过核酶转导的T细胞在感染HIV-1的病人体内可以生存很长时间且是安全的。
随着逐步发展的分子生物学和成熟的基因治疗方法,不久的将来临床抗HIV的感染将被基因治疗方法所取代。
3.5核酶在植物抗病毒的研究
烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)是分布广泛、侵染性很强的一类植物病毒,能感染我国30个科中的199种植物,在我国对烟草、蔬菜、花卉等植物的生长具有严重的危害。
这些年以来,随着人们对核酶的深入研究,在植物中利用核酶进行抗病毒研究已成为新的热点。
许多研究者根据TMV基因组的基本结构,成功合成了针对TMV不同识别位点的核酶,并取得了显著的成果。
杨建华等(1998)将核酶Rz-2转化到烟草原生质体中,这个Rz-2是他们设计的特异切割烟草花叶病毒RNA的锤头状核酶。
通过对烟草原生质体侵染性的检测发现,转基因原生质体中TMV侵染程度比未转基因的对照组明显降低[27]。
水稻条纹叶枯病(Ricestripedisease)是水稻主要病毒病害之一。
在我国该病是在1964年首次被
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