Aria III技术说明.docx
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Aria III技术说明.docx
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AriaIII技术说明
BDAriaIII高端分选型流式细胞仪
碧迪医疗器械(上海)有限公司生物科学部
第一部分高端分选型流式细胞仪产品及市场概述
流式细胞仪(FlowCytometer,FCM)一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。
概括来说,流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
随着各项相关技术的迅速发展,流式细胞技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。
我们可以看到,目前全球商业化流式细胞仪产品的研究开发主要遵循两个方向:
一类以分析功能为主的,应用于临床检测及常规的科研系统;另一类是具备高速分选功能的高端科研型,研发趋势是越来越多的荧光检测参数,同时越来越快的分选速度,以适应越来越高的科学研究的需求。
在分选型的高端产品来说,BD公司、Dako-Cytomation与Beckman-Coulter公司都相继推出了几代产品。
1999年BD公司在原FACSVantage的基础上,推出了FACSVantageSE(分选升级型,将细胞分选功能推到一个新的高度,25,000个细胞/秒,同时增配Accudrop等选件,使得分选调试变得简单),2000年又在其基础上推出Diva系统,这是一个全数字化的系统,分析速度大大提高,同时做到四路分选。
同期的Beckman-Coulter公司的同类产品是Altra,该产品雷同于BD的FACSVantageSE,但在性能参数方面比FACSVantageSE都要差,竞争力相对较弱,于2003年停产。
同期,在高端分选型流式细胞仪市场上Dako-Cytomation公司于1996年推出了Moflo,这款产品可进行高速分析和分选,但因为操作复杂,性能不稳定而未得到广泛使用,2007年Beckman-Coulter公司在自己无法研发出新一代的流式细胞分选仪的情况下,从DAKO公司收购了Moflo,并更名为MofloXDP,但并未改变Moflo的硬件结构。
以上这三个型号都属于1990年代的仪器,共同的缺点是:
一、最多只能同时使用2-3根激光器,无法跟上现代多激光多色的发展方向;二、都需要在三维空间手工调试激光光路,操作方法复杂,自动化程度低,只有少数极具操作经验的实验人员才能熟练掌握,无法成为实验室研究的常规手段;三、检测灵敏度低,无法进行100MESF以下的检测,无法发现很多低表达的特异性细胞亚群。
真正的流式分选技术的革命诞生于2003年,BD公司推出了FACSAria,这是Aria系列高速流式分选仪的第一代产品。
Aria创新地在流式细胞分选仪上使用了多项独一无二的先进技术,包括前后光纤技术、石英流动检测池技术和全反射荧光信号收集技术,结合BD专利的Accudrop自动液滴延迟时间确定技术,使得Aria成为当代流式分选仪中当之无愧的冠楚。
2008年,Aria系列的第二代FACSAriaII诞生,在原有的基础上增加了激光器和喷嘴的选择,也对仪器的液路系统进行了变革。
BD的创新总是在持续,2010年,BD又推出了当今最新型号FACSAriaIII,将流式细胞仪分选仪在多激光多色,超高灵敏度,自动化操控和应用多功能化的创新推至顶点。
高端分选型流式细胞仪市场分布状况
自1980年北京师范大学生物系薛少白、宋平根教授引进中国第一台流式细胞仪-BD公司生产的FACSIII以来,二十多年来,中国的流式细胞仪市场总量与应用水平已经有了长足的发展与进步,被广泛地应用于各个科研院所、高校、临床医院和CDC等单位。
各型流式细胞仪装机总量已达到2000台,其中BD公司的流式占1600台。
其中分选型流式已达到近120台,BD公司的分选流式占90台。
从上述数字分析,我们可以很清楚地看到,BD公司的流式产品在这一高端市场上面占有绝对的优势。
第二部分流式细胞仪涉及的科研领域
自从1973年,BD公司推出世界上第一台流式细胞仪以来,流式分析和分选技术不断地发展。
目前流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技细胞分析和分选技术,能够在单细胞和细胞亚群的水平上,对细胞结构和细胞功能进行准确、高速和大信息量分析和分选。
目前,流式细胞技术它不仅可以测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可以检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞因子、细胞内DNA、RNA含量等;它可对群体细胞在单细胞水平进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,从同一个细胞进行多参数定量分析;并且能够分类收集(分选)出某一亚群细胞或单细胞。
目前,该技术已经广泛应用于基础研究与临床检测,在免疫学、细胞生物学、遗传学、血液学、肿瘤学、药物学、植物学、水生物学、分子生物学等学科广泛应用。
是现代生物医学研究的一个全新的视角和强有力的手段。
流式细胞仪的主要科研领域包括:
细胞表型分析:
在研究免疫疾病,血液疾病,肿瘤,不同发育阶段组织胚胎以及干细胞时都常常需要通过对细胞膜表面抗原,受体类型,胞内蛋白等多方面的检测分析来判断细胞的类型,数量;流式细胞分选仪配合针对不同目标特异性的抗体就可以做到对这些细胞的分析和分离。
流式细胞技术是细胞表型分析的最准确和最经典的方法。
细胞增殖及细胞周期:
细胞周期与细胞增值与生命科学有着密切的关系,比如肿瘤的发生,增殖和转移,胚胎的有序发育,成熟机体的健康,组织的再生及衰老也无不与细胞周期密切相关。
某些细胞周期蛋白基因本身就是原癌基因。
流式细胞仪一直以来就时细胞周期研究的最有效的工具之一,流式细胞仪对DNA、RNA含量及细胞周期的分析具有独特的特点:
(1)测定细胞内DNA变异系数小,一般为1%~2%;
(2)可正确分辨二倍体、四倍体、近二倍体及非整倍体,准确进行细胞周期分析;(3)分析数据多、统计结论可靠;(4)分析结果直接以图形形式显示,形象直观。
细胞凋亡及凋亡信号传导
细胞凋亡与信号转导是生命科学和医学领域研究非常广泛的方向之一,通过特异性抗体对凋亡分子与各信号转导通路中的蛋白分子进行标记,可发现新的凋亡相关分子和新的信号通路分子,对各种免疫机制的发现有着重大的意义。
细胞功能检测
如活化、细胞因子、磷酸化蛋白、膜电位、钙流及PH值等检测:
这些研究广泛涉及到免疫学、药理学、细胞学、病理学、组织胚胎学、蛋白质组学,病毒学等领域。
流式细胞分选仪依靠其多参数高速分选功能,可以通过细胞的不同大小,形状,不同表面标记和细胞不同状态下的某种特性分析和高速分选出相应的把细胞和分子。
细胞特异性标记物的分析
用可以结合细胞表面或胞内特异性抗原的单克隆抗体处理待分析的材料后,再利用免役荧光的方法和流式细胞技术相结合,即可辨认和区分出带有特异性抗原的细胞,这样,就为检测某些膜上或胞内含特异性抗原的细胞提供了一种简捷途径,如培养的细胞群体,在不同的生长阶段细胞表面会有不同的表面抗原,要鉴别某一生长期的细胞就可以应用这种方法。
干细胞的鉴定与分离
干细胞研究是近年来最热门的研究方向之一,但对它的种类,分布以及功能还不是很明确。
通过流式细胞仪鉴定不同种类的干细胞,发现新的干细胞并分离培养,研究不同干细胞在不同分化和发育阶段的功能,是近来研究干细胞最为有效的方法。
在医学上通过分离相应的干细胞进行干细胞治疗也是相当有价值的研究方向。
流式细胞分选仪的无菌分选功能为后续的细胞的培养和细胞治疗提供了有效的手段。
细胞间的相互作用
细胞的相互作用,如(NaïveT/Treg/TH17等)、DC/MDC、干细胞等是免疫和细胞生物学近年来非常受关注的研究领域。
通过不同细胞表面的特异性标记,在流式细胞仪上的分析可以发现多种疾病的发生和发展过程中不同细胞之间的相互作用机理。
药物研究,开发,药效评估
流式细胞仪独特的多参数分析功能,可以检测不同药物对所研究的细胞群的作用,做到对药物效果的评价,对开发各种药物是一种非常有效的研究工具。
可溶性分子的研究
如细胞因子及受体,趋化因子及受体,凋亡相关蛋白等
乳化油颗粒检测
乳化油颗粒是油的小滴,可浸入在水中,其中包含在其中的小水滴。
乳化油颗粒正在为仿生矿物形成的调查和药物输送途径研究的热点。
作为一种药物输送途径,一些有用的化合物可以被储存在水相中,并被油所包裹。
了解液滴均匀性,以及在不同阶段中的化合物释放率十分重要。
流式细胞技术能够对乳化油颗粒的大小,内含物质的数量进行准确的检测,从而成为药物机理研究的重要手段。
基因转染
如荧光蛋白GFP/RFP/CFP/YFP等检测以及FRET等蛋白间相互作用等研究。
荧光蛋白转染是日常研究中最为常用的研究手段之一,通过561nm,488nm的激光可以有效的激发荧光蛋白分子,鉴定转染效果以及追踪转染的细胞,分选出感兴趣的细胞群。
肿瘤研究
通过流式细胞仪分选出感兴趣的肿瘤细胞,可以对肿瘤细胞进行分子生物学,免疫学和细胞生物学方面的后续研究。
包括:
DNA含量,P53/Bcl-2,nm23,CD44亚型,肿瘤多药耐药(MDR),ER(雌激素受体),Cyclin(细胞周期蛋白)检测等等。
染色体核型分析
染色体核型分析及分选在遗传病研究,基因文库的建立上起了重要作用;某些物种的染色体根据其AT和GC含量的不同可以进行区分并分选出来;通过Hochest/色霉素A3染色,激光器激发核酸燃料对染色体进行分析并分离。
各种类型稀有细胞的分离,纯化或富集培养
稀有的细胞群的分离纯化一直是传统研究手段无法解决的问题,现在可以通过流式细胞分选仪轻松的分选出感兴趣的稀有细胞群,在体外对这些细胞进行培养。
比如SP细胞,流式细胞分选仪的375nm的激光器可以有效的激发Hoechst33342等核酸燃料,用以分离SP细胞。
单克隆细胞分选
流式细胞仪的ACDU多孔板单克隆定位分选功能可以做到在细胞培养板的指定位置分选出1到数十万个细胞,使得传统繁琐的单克隆筛选变的异常的简单和有效。
成分分选
高速流式细胞分选仪独特的成分分选功能,可以根据科研人员自行设定的不同比例分选出研究的一群细胞,可发现这些细胞在不同比例存在条件下的功能差异,细胞调控以及相互作用。
病原微生物学研究
通过流式细胞仪研究病原微生物的治病机理,治病分子以及感染过程中的免疫应答。
血液学研究
血液学研究领域会涉及到免疫功能相关的许多marker的改变、细胞活化、信号转导、细胞内功能分子的改变、细胞间相互作用等等。
所涉及到的分子和检测物如网络般盘根错节,这就要求我们必须要进行多参数的分析才能较全面深入地探索其内在的规律和发现新的现象。
流式细胞分选仪的多参数高速分选功能可以同时分析尽可能多的标记物,为找到不同Marker之间的关系和之间的机理提供了有效的方法,正因为如此配制多色荧光参数检测的流式细胞分选仪成为血液学分研究工作者的最有效的工具。
植物与水生生物的检测
如藻类、叶绿素(自发荧光检测),反应细胞的活形状态。
DNA染色与膜的选择性渗透性检测(PI+EB),反应细胞膜完整性和细胞生活能力膜脂活性检测(FDA探针),反应生物细胞的代谢活性膜电位检测,反应细胞繁殖生长的状态DNA含量测定,界定种群细胞细胞周期分配、生物的分裂率等。
第三部分先进流式细胞仪的发展趋势
自从1973年,BD公司推出世界上第一台流式细胞仪以来,流式分析和分选技术不断地发展。
目前,流式细胞技术它不仅可以测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可以检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞因子、细胞内DNA、RNA含量等;它可对群体细胞在单细胞水平进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,从同一个细胞进行多参数定量分析;并且能够分类收集(分选)出某一亚群细胞或单细胞。
目前,该技术已经广泛应用于基础研究与临床检测,在免疫学、细胞生物学、遗传学、血液学、肿瘤学、药物学、植物学、水生物学、分子生物学等学科广泛应用。
是现代生物医学研究的一个全新的视角和强有力的手段。
当前最先进的流式细胞分选技术的发展主要体现在以下几个方面:
1、多激光多色分析技术
从最早的单激光流式,到近期的双激光和三激光,到当代最先进的六激光技术;从最早的单色和双色分析,到近期的六色到十色分析,到当代最先进的十八色分析。
多激光多色分析技术的发展是先进流式分选技术发展的一个重要标志。
多色分析技术能够在一次实验中大大提高信息量,各个不同的检测指标之间的相互关系也越清晰。
同时也可以做到节约标本,节省试剂,降低工作量。
2004年,Nature杂志上就发表了讨论12色以上流式技术的应用的文章。
多激光技术不仅可以在多色分析技术的应用中为不同的荧光素提供特殊的激发波长,减少荧光信号间的相互干扰,同时,特殊波长的激光器也支持不同的特殊应用。
比如,561nm激光检测RFP,375nm激光检测SP细胞,445nm激光检测CFP等。
目前国际最先进的流式分选仪器能够同时安装6根不同波长的固体激光器,充分满足各种不同检测的需求。
2、高灵敏度检测技术
仪器灵敏度的提高意味着检测能力的提高,能够检测到以前无法检测到的信号,这非常有利于发现一些低表达的细胞群体。
这些低表达的细胞群体以往由于检测技术灵敏度的限制,无法被发现,而他们往往又是研究人员专注的重点。
因此,提高灵敏度是先进流式技术发展的又一重要标志。
当代最先进的流式的检测灵敏度在FITC上可以小于100MESF,在PE上可以小于30MESF。
3、自动化控制技术
流式细胞技术作为一种高精尖的技术,以往只能被少数非常有实验经验的技术人员所熟练掌握。
但当前,流式细胞技术已经越来越广泛地被各种实验所应用。
因此,发展出一套能够让实验人员能够方便、快速和准确使用的实验设备是流式发展的趋势。
目前,最先进的代表技术包括能够让实验人员从繁琐耗时的仪器光路调节中解脱出来的固定光路技术和能够自动确定液滴延迟时间的Accudrop技术。
这两个技术的使用,让流式分选技术真正的成为了一个能让实验室技术人员能够快速掌握和准确使用的技术。
第四部分AriaIII的主要特点
AriaIII是全球领先的流式细胞仪供应商美国BD公司在2010年推出的最新型号的高速流式细胞分选仪。
Aria系列流式细胞分选仪,在全球高端流式市场上占有80%以上的市场份额,是性能最尖端,实验结果最可靠和自动化程度最高的流式细胞分选仪系列。
2010年,BD推出的AriaIII高速流式细胞分选仪具有以下杰出优势,以服务于广大科研人员从事最顶尖的实验研究。
与其他老一代的流式分选仪比较,AriaIII具有以下无可替代的优势:
1、能够同时安装多达6根固体激光器,同时使用4根不同波长的激光器。
AriaIII标准配置能够同时安装488nm,633nm,561nm,375nm,405nm和445nm六根不同波长的激光器并同时使用其中的4根,以满足不同科研领域的应用需求,符合现代流式细胞仪技术多激光多色的发展方向。
每个激光器都有其特殊的应用,在现代的高级应用中,多色的流式细胞仪实验往往需要4根以上的激光器同时使用。
AriaIII仪器升级方便,能够随时方便地添加激光,能够满足现在和将来的发展需求。
而Beckman公司90年代推出的MOFLOXDP同时只能使用三根激光器,标准配置也无法安装561nm,375nm,445nm激光器,显然已经无法满足现代技术的发展,仪器应用领域窄小,无法满足现在和将来的需求。
X-6激光器底盘系统
不同激光器,对应不同的应用范围:
1)488nm激光:
用于细胞表面或胞内蛋白/抗原检测分析,细胞增殖、活性、凋亡及周期和倍性分析,荧光蛋白检测,基因和信号分子检测,细胞器的分析,可溶性蛋白检测等等。
是流式细胞仪最常用的激光器之一。
可激发的荧光素包括:
FITC,PE,PerCP,AlexaFluor®488,GFP等。
2)633nm激光:
用于细胞表面或胞内蛋白/抗原检测分析,基因和信号分子检测等等。
是流式细胞仪最常用的激光器之一。
可激发的荧光素包括:
APC,AlexaFluor®647,BDAPC-H7,APC-Cy7等。
3)561nm激光:
用于细胞表面或胞内蛋白/抗原检测分析,可激发的荧光素包括:
PE,PE-TexasRed®,PE-Cy5,PE-Cy7,RFP,mCherry等。
其中利用561nm激光器激发PE,可以大大减小PE和FITC的光谱重叠,极大提高检测灵敏度和分辨率,从而发现一些以前不能被发现的低表达的细胞群体和特殊表面标志物;同时,561nm激光器可以鉴定RFP转染效果以及追踪转染的细胞,并分选出感兴趣的细胞群;而基于mCherry的双分子荧光互补系统研究(BiFC),更能够检测细胞内蛋白质之间的相互作用,具有简单,快速,直观,灵敏及定位等特点。
4)375nm激光:
结合BD公司的最新NGX石英流动检测池,可改变以前只能采用大功率355nm激光检测SP细胞的现状。
在干细胞和细胞治疗研究中,能够高灵敏和高特异性分析和分选SP侧群细胞。
同时,375nm激光可以用于细胞周期检测,尤其适合活细胞的细胞周期倍性分析;钙离子的检测(一种荧光染料实现结合钙和游离钙的同时检测)也可以通过375nm激光检测Indo完成。
5)405nm激光:
紫色荧光石最新发展出来的一类新型荧光,主要包括Qdot系列,BDHorizonV500,AmCyan,BDHorizonV450,PacificBlue™荧光素。
在流式细胞技术多激光多色的发展方向中,紫色激光是流式技术由6色以下发展到8色和10色的关键激光,其激发的紫色荧光素能够很好的与红色和蓝色共同使用,荧光信号强,荧光干扰少。
而Qdot是一种生物学领域和纳米学领域相结合的产物,对于细胞成像来说具有吸收性高、量子产量高等优点,其具有超强的荧光稳定性,光谱范围广,可应用于肿瘤靶标细胞的标记与示踪。
6)445nm激光:
能够高灵敏和高分辨率地检测CFP荧光蛋白,进行转染效果评估和追踪转染细胞,也是进行细胞内蛋白质之间的相互作用研究的重要手段。
同时,445nm激光配合375nm激光,也是染色体检测和分选的主要手段。
2、AriaIII能够同时检测18色荧光
流式细胞仪多激光多色的发展能够大大的加快科研的进展,能够同时检测越多的荧光信号,就能够大大地节约实验时间、减少试剂消耗,并且,各个不同的检测指标之间的相互关系也越清晰。
因此,在现代的流式实验中,科学家都最求更多的荧光信号能够被同时检测,同时检测10色以上的检测能力,是当前先进流式检测技术的标志。
AriaIII能够同时检测18个报告荧光信号,加上FSC和SSC,共20个信号。
为研究人员一次提供巨大的信息量,加速科研的进展速度。
八角形和三角形全反射荧光信号收集系统
AriaIII的18色检测系统配置
11色荧光染色组合流式检测完成的鼠科动物胸腺基质细胞成份的全面特征鉴定。
鉴定胸腺造血和非造血基质亚群。
而Beckman公司90年代推出的MOFLOXDP同时只能检测10色荧光,仪器应用领域相对窄小,无法满足现在和将来的需求。
3、AriaIII采用了最新型NGX石英流动检测池
自从2003年,AriaI开始在高速流式细胞分选仪上使用石英流动检测池以来,经过不断地改进,最新的AriaIII上使用了最新一代的石英流动检测池NGX。
NGX石英流动检测池的使用,不仅使所有用户从繁琐的日常光路调节中解脱出来,而且还大幅提高了检测效果。
除了细胞周期检测的分辨效率更高以外,AriaIII的用户只要使用375nm激光器就能在NGX石英流动检测池上对SP细胞进行完美的分析和分选。
使得昂贵的355nm激光器变得不再需要,可以节约大量的科研经费。
NGX新一代石英流动检测池
小鼠骨髓SP细胞
•小鼠骨髓来源的细胞利用Hoechst33342,c-Kit,Sca-1,系列标志物标记,在装有375nm激光器和新一代NGX石英流动检测池的BDFACSAriaIII上采集数据。
•SP群体(红色)全是c-Kit+Sca-1++。
•使用的抗体是c-KitPE,Sca-1PE-Cy™7,LineageFITC,CD45APC-Cy7,PI,HoechstBlue,和HoechstRed。
肿瘤细胞株的SP细胞
•人HT-29结肠癌细胞使用Hoechst33342染色,在装有375nm激光器和新一代NGX石英流动检测池的BDFACSAriaIII上采集数据(左侧散点图)。
•作为对照样本,SP表达被抑制(右侧散点图)。
4、AriaIII将流式细胞分选仪的灵敏度提高到了极限
由于使用了BD专利的NGX石英流动检测池和八角型全反射信号收集系统,AriaIII的灵敏度提高到了前所未有的FITC85MESF;PE29MESF。
这是其他流式分选仪灵敏度的一倍(比如,MofloXDP的灵敏度是FITC150MESF;PE100MESF)。
当代的流式分选技术要求能够分选和检测真正的弱表达细胞群体,这样才能发现别人所不能发现。
而AriaIII的超高灵敏度正式符合了这个特殊要求,是最先进流式技术的体现。
5、AriaIII将流式细胞分选的自动化程度提高到最高
流式细胞分选技术的应用已经日趋成为免疫学和细胞生物学实验室的常规技术手段,越来越多的研究人员(包括研究生)都要依靠流式细胞技术对细胞的分型,胞内和细胞表面的标志物、蛋白和核酸等进行检测,并将目标细胞精确和快速地分选出来。
因此,需要改变以往的流式分选仪操作复杂,耗时耗力的弊端,让每个实验室的人员都能简便快速地掌握。
AriaIII采用了固定光路系统,完全摒弃了耗时的光路调节步骤;采用了专利的Accudrop技术,全自动确定液滴延迟时间,无需任何手工调节,准确和自动的分选目标细胞。
其高度的自动化程度完全解决了很多实验室“买得起,用不好”状态,将每台仪器的功能发挥到最大。
第五部分FACSAriaIII使用的的几项核心专利技术说明
一、石英流动检测池分选系统
UnitedStatesPatent
7,544,326
Norton, etal.
June9,2009
Fixedmountedsortingcuvettewithuserreplaceablenozzle
在流式分选仪上使用石英流动检测池,能够将仪器中的检测光路完全固定,不会发生任何光路偏移,无需任何光路调整。
在流动检测池下方有可更换的喷嘴,适应不同分选需求。
喷嘴采用固定插拔锁扣装置,更换喷嘴后无需调整喷嘴位置和光路。
而传统的在空气中检测的流式分选仪(如MofloXDP等),光路不固定,每天需要大量时间调节光路,而且在更换喷嘴后也需要重新调整光路,费时费力。
Abstract
Aflowcellandflowcytometerinwhichanozzleattheendofaflowchannelisdisposedonaremovablesubstrateheldataregisteredlocationonaflowcell.Otherelementsincludingilluminationoptics,lightcollectionoptics,andtheflowcellmaythenbepositionedatfixedlocationsandwouldnotrequiresubsequentperiodicadjustment.
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