Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol mRNA的分离纯化.docx
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LoadingBuffer煮细胞抽提总蛋白ProtocolmRNA的分离纯化
LoadingBuffer煮细胞抽提总蛋白Protocol
1.细胞计数(约1×106的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);
2.预冷1×PBS500ul重悬洗一次,转至500ulEP管(2000rpm×5min);
3.去上清,后甩一次,将上清去尽;
4.按每1×106的细胞加50ulloadingbuffer加入2×loading;
5.Vortex一下,煮10~15min一次×2~3次直至无粘丝;
6.每次煮好将其放于冰上,静置约2min,Vortex一下,再甩一下;
7.三次后用枪吸起,如没有粘丝,即可;
8.每次上样约5ul(50ug/ul蛋白)
RIPA裂解抽提总蛋白Protocol
1.细胞计数(约1×107的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);
2.预冷1×PBS1ml重悬洗2次,转至1.5mlEP管(2000rpm×5min);
3.去上清,后甩一次,将上清去尽;
4.按照如下比例加入裂解试剂:
RIPA:
300ul/1×107细胞
PMSF:
3ul(1:
100)
Cocktail:
0.3ul(1:
1000)
5.吹打均匀,冰上放置30-40min,中间每10分钟Vortex一次;
6.4℃预冷离心:
10000rpm×10min;
7.收集上清,转移至已预冷新EP管,即为总蛋白。
【为了浓缩蛋白,加RIPA的量改为200ul或者更低,可稍微延长冰上裂解时间,而RIPA
(1)+PMSF(1:
100)+Cocktail(1:
1000)的比例不变】
核,浆蛋白抽提Protocol
一.收核-浆蛋白
收浆蛋白
1.细胞计数(约1.5×107的细胞),离心收集细胞(1100rpm×5min);
2.用4℃预冷的PBS重悬,转至1.5mL的EP管中,离心(4000rpm×5min,4℃);
3.去上清,加入ABuffer1mL/1×107cell,重悬,4℃放置10min,离心(2500rpm×3min,4℃);
4.去上清,加入A’Buffer250uL/1.5×107cell,重悬,4℃放置3min,离心(5000rpm×1min,4℃),吸取上清(上清是浆蛋白);
收核蛋白
5.再用A’Buffer500uL/1.5×107cell,重悬,4℃放置3min,离心(5000rpm×1min,4℃),吸走上清,12000rpm×30sec,把上清完全吸干净;
6.剩余沉淀中加入B’Buffer(或者RAPI)50uL,重悬(振荡),4℃放置40min(每隔10min振荡一次);
7.离心(12000×10min,4℃),取上清即为核蛋白,-80℃保存。
BufferA的配制:
终浓度
母液
配40Ml(10ml)溶液所需的量
HepesPH7.9
10mM
1M
400uL(100ul)
MgCl2
1.5mM
2M
30uL(7.5ul)
KCl
10mM
250mM
1.6mL(400ul)
DTT
0.5mM
0.1M
200uL(50ul)
剩余体积用ddH2O补足至要求体积!
BufferA’的配制:
BufferA’(2ml)=1960ulBufferA+40uL10%NP-40+20uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin
BufferA’(1ml)=980ulBufferA+20uL10%NP-40+10uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin
(Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加)
BufferB的配制:
终浓度
母液
配40mL(10ml)溶液所需的量
HepesPH7.9
20mM
1M
800uL(200uL)
甘油
25%
50%
20mL(5mL)
NaCl
0.42M
3M
5.6mL(1.4mL)
EDTA
0.2mM
0.5M
16uL(4uL)
DTT
0.5mM
0.1M
200uL(50uL)
NP-40
0.2%
10%
800uL(200uL)
剩余体积用ddH2O补足至要求体积!
BufferB’的配制:
BufferB’=1mLBufferB+10uL10mg/mLPMSF+0.5uLAprotinin(可以用cockltail代替)
核基质蛋白抽提Protocol
1、细胞计数(约1×107的细胞),离心(1100rpm×5min)收集细胞;
2、用4℃预冷的PBS重悬,将细胞移至1.5mlEP管中,1×PBS洗一遍;
3、加300ulRIPA/1×107的细胞,裂解细胞,至冰上15-30min;
RIPA+PMSF(1:
100)+Cocktail(1:
1000)
4、4℃预冷离心:
13000rpm×10-15min;
5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5mlEP管,冰上备用(总蛋白);
6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍;
7、加入Urea-Lysisbuffer10-15ul裂解pellets,vortex10min;
8、4℃预冷离心:
13000rpm×10min;用BufferA90ul稀释,此为核基质蛋白。
RIPA(PH8.0):
150mMNaCL
1%NP-40
0.5%DOC
0.1%SDS
50mMTris
Urea-Lysisbuffer(PH8.0):
100mMNaH2PO4
10mMTris-HCL
300mMNaCL
8Murea
BufferA:
100mMNaH2PO4
10mMTris-HCL
300mMNaCL
1%TritonX-100
cytoplasmiccellfractionswerepreparedbyincubatingthecellsinicecold
Iso-Hibuffer
140mMNaCl
25mMTris[pH7.4]
1.5mMMgCl2)
0.5%NonidetP-40
for5minandthensubjectingthemtolow-speedcentrifugationtocollectthenuclei.Nucleiwereincubatedin
high-saltextractionbuffer
20mMHEPES(pH7.9)
25%(v/v)glycerol
0.5MNaCl
1.5mMMgCl2
0.2mMEDTA
0.5mMphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)
0.5mMDTT;
for1hat4C.TheDNA-particulatefractionwaspelletedbymicrocentrifugation(15,000rpm),washedonceinhigh-saltbuffer,solubilizedinradioimmunoprecipitationassaybuffer(RIPA),andsonicatedtosheertheDNA.Equalamountsofallfractionswereprecipitatedwithtrichloroaceticacid,resuspendedinproteinsamplebuffer,andseparatedonasodiumdodecylsulfate(SDS)–10%polyacrylamidegel.
AccuratetranscriptioninitiationbyRNApolymeraseIIinasolubleextractfromisolated(nuclearextraction)
bufferA:
10mMHEPES(pH7.9at4C)
1.5mMMgCl2
10mMKC1
0.5mMDTT;
bufferB
0.3MHEPES(pH7.9)
1.4MKC1
0.03MMgCl2;
bufferC
20mMHEPES(pH7.9)
25%(v/v)glycerol
0.42MNaCl
1.5mMMgCl2
0.2mMEDTA
0.5mMphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)
0.5mMDTT;
bufferD
20mMHEPES(pH7.9)
20%(v/v)glycerol,
0.1MKCl,
0.2mMEDTA
0.5mMPMSF
0.5mMDTT
DTTandPMSFwereaddedfreshtothebuffersjustbeforeuse.
1,Pelletedcellswerethensuspendedinfivevolumesof4Cphosphatebufferedsalineandcollectedbycentrifugationasdetailedabove;subsequentstepswereperformedat4°C.
2,ThecellsweresuspendedinfivepackedcellpelletvolumesofbufferAandallowedtostandfor10min.
3,Thecellswerecollectedbycentrifugationasbeforeandsuspendedintwopackedcellpelletvolumes(volumepriortotheinitialwashwithbufferA)ofbufferAandlysedby10strokesofaKontesallglassDouncehomogenizer(Btypepestle).
Thehomogenatewascheckedmicroscopicallyforcelllysisandcentrifugedfor10minat2000rpminaSorvallHG4Lrotortopelletnuclei.Thepelletobtainedfromthelowspeedcentrifugationofthehomogenatewassubjectedtoasecondcentrifugationfor20minat25,000ga(SorvallSS34rotor),toremoveresidualcytoplasmicmaterialandthispelletwasdesignatedascrudenuclei.Thesecrudenucleiwereresuspendedin3mlofbufferCper109cellswithaKontesallglassDouncehomogenizer(10strokeswithatypeBpestle).Theresultingsuspensionwasstirredgentlywithamagneticstirringbarfor30minandthencentrifugedfor30minat25,000g(SorvalSS34rotor).Theresultingclearsupernatantwasdialyzedagainst50volumesofbufferDforfivehours.Thedialysatewascentrifugedat25,000g(SorvallSS34rotor)for20minandtheresultingprecipitatediscarded.Thesupernatant,designatedthenuclearextract,wasfrozenasaliquotsinliquidnitrogenandstoredat-80°.Theproteinconcentrationwasusually6to8mgpermland15to20mgofproteinwereobtainedfrom109cells.
mRNA的分离纯化
【实验原理】
真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。
真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物,因此,高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。
哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5gRNA,理论上认为每克细胞可分离出5~10mgRNA。
其中rRNA为75%~85%,tRNA占10%~16%,而mRNA仅占1%~5%,并且mRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,表达丰度也不一样。
真核生物mRNA有特征性的结构,即具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly(A)尾,通常用poly(A+)表示,这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。
当总RNA流经寡聚(dT)(即oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,即可得到较纯的mRNA。
目前常用的mRNA的纯化方法有:
(1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法;
(2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;
(3)其它一些方法:
如寡聚(dT)-磁性球珠法等。
本实验应用方法
(1)进行mRNA的分离纯化。
【试剂与器材】
(一)试剂
1.0.1mol/LNaOH,每组200mL
2.寡聚Oligo(dT)-纤维素
3.加样/洗涤缓冲液1:
0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6),每组250mL
或0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%SDS。
4.洗涤缓冲液2:
0.1mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6),每组250mL或10mmol/LTris-HCl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.05%SDS。
配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、EDTA(pH8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。
5.5mol/LNaCl,每组10mL
6.3mol/LNaAcpH5.2,每组10mL
7.无RNase双蒸水(DEPC水),每组100mL
8.70%乙醇,每组10mL
注意:
溶液5,6的配制都应该加0.1%DEPC处理过夜,溶液1,3,4,8则用经0.1%DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。
溶液配制后,最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。
(二)器材
1.恒温水浴箱
2.冷冻高速离心机
3.紫外分光光度计
4.巴斯德吸管
5.玻璃棉
6.5ml一次性注射器
【操作方法】
(一)oligo(dT)纤维素的预处理
1.用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo(dT)纤维素。
2.将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0mL,用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。
3.用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素,直到流出液的pH值小于8.0。
4.将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出,用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮,浓度约为0.1g/mL,保存在4℃待用。
(二)总RNA浓度的调整
1.把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中,如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL,则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL,总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。
把RNA溶液置于65℃水浴加热5分钟,然后迅速插在冰上冷却。
2.加入1/10体积5mol/LNaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5mol/L。
(三)mRNA的分离
1.mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合:
用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素,按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中,盖上盖子,颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。
于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。
总RNA(mg)
寡聚Oligo(dT)-纤维素(mL)
洗涤缓冲液1,2(mL)
洗脱体积(mL)
<0.2
0.2
1.0
1.0
0.2-0.5
0.5
1.5
1.5
0.5-1.0
1.0
3.0
3.0
1.0-2.0
2.0
5.0
5.0
2.转移:
取1个5ml的一次性注射器,取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端,并把它固定在无RNase的支架上,再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器,推进塞子直至底部,把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中(保留至确定获得足够的mRNA)。
3.洗涤:
根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1,温和振荡,充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子,用无RNase的离心管收集洗出液。
测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时准备洗脱。
4.洗脱:
根据上表直接用注射器慢慢吸取适量(2-3倍柱床体积)的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
5.测定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脱液组分于4℃,2500g,离心2-3分钟,上清转移至新的离心管中,去掉残余的oligo(dT)-纤维素。
6.沉淀:
洗脱液中加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2),再加入2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀后,-20℃30分钟或放置过夜。
7.离心收集:
12000g,4℃离心15分钟,小心弃去上清,mRNA沉淀此时往往看不见,用70%乙醇漂洗沉淀,12000g,4℃离心5分钟,小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水,立即用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
8.定量:
测定OD260和OD280,计算产率以及OD260/OD280的比率(同上一实验)。
【注意事项与提示】
1.整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
2.提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量的先决条件。
3.总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA不纯。
4.RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5分钟,这一步很重要,其作用
(1)破坏mRNA的二级结构,特别是poly(A+)尾处的二级结构,使poly(A+)尾充分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;
(2)解离mRNA与rRNA的结合。
加热后应立即插入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
5.应注意mRNA不能被DNA污染,即使是1ppmDNA污染,也可严重影响实验结果。
6.mRNA制备后,可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。
提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状,无明显区带,但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内(如下图)。
一般来说,经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留,但一般来说不会对后续实验造成很大的影响,如果样品充足,可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次,进一步提高其纯度。
图3.1mRNA变性琼脂糖凝胶电泳示意图
Lane1,0.24–7.5kbRNA分子量Maker;
Lane2,老鼠肝脏总RNA;
Lane3,老鼠肝脏mRNA
7.为防止mRNA降解,应避免多次冻融,可将mRNA少量分装后保存。
另外,如果有低温冰箱,最好在-70℃~-80℃保存。
也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8.寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。
每次用前需用NaOH、灭菌ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
9.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
【实验安排】
1.第一天:
试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理(0.1%DEPC浸泡或高温干烤)。
2.第二天:
进行
(一)、
(二)和(三)1-6。
3.第三天:
进行(三)7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA。
4.为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解,最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。
其他:
引物的设计一般遵循的原则:
1)典型的引物20-24个核苷长。
引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性,同时因为比短序列杂交慢,从而降低了产量。
2)设计
- 配套讲稿:
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- 特殊限制:
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