蛋白质定量与定性分析报告.docx

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蛋白质定量与定性分析报告

蛋白质定量分析与定性分析报告

此次“蛋白质定量分析与定性分析”报告总共包括蛋白定量、蛋白简单定性、蛋白功能定性三个部分组成。

师兄的报告内容翔实，介绍生动，让我受益匪浅。

1.蛋白质定量分析

蛋白质定量分析是确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白的含量。

蛋白质的定量分析一般可从三个方面入手，一是基于蛋白质的元素组成特点，二是基于蛋白质的化学显色反应，三是基于蛋白质的光吸收特性。

蛋白质定量分析的方法有：

280紫外吸光比色法、经典Bradford与Lowry检测法、BCA（二喹啉加酸）检测法、疏基测定检测法。

1.1280紫外吸光比色法

这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分及其含量，

通常用于柱层分析过程中检测蛋白质的洗脱峰。

如下图，蛋白质中的Trp、Tyr、Cys残基含有共轭双键，在280nm有一紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度成正比，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。

可以通过A280与A260的差值来计算出蛋白质浓度，如：

蛋白质浓度（mg/l）=1.45×A280-0.74×A260。

蛋白质的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽键引起。

可通过214nm与225nm的差值来计算出蛋白质的含量。

较为精确的公式为：

ε（280）（M-1cm-1）=（#Trp）（5,500）+（#Tyr）（1,490）+（#cystine）（125）.

1.2经典Bradford与Lowery检测法

1.2.1Bradford检测法

这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。

该法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。

在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当于蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。

蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白的含量。

蛋白质与色素结合反应很快，约在2min左右的时间内达到平衡，在室温1h之内是稳定的。

在0.01~1.0mg蛋白质/ml范围内，蛋白质含量与OD595值成正比。

这种反应快速而敏感，几乎没有蛋白质损失，但是对各种纯化蛋白质反应不同，用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性，灵敏度在25ug/ml~200ug/ml。

下图为用Bradford检测蛋白质含量与吸光度曲线。

1.2.2Lowery检测法

这一标准、快速的蛋白质定量分析检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除。

原理是，蛋白质在碱性条件下与双缩脲试剂中的Cu2+形成络合物。

由于蛋白质含芳香族氨基酸残基，生成的络合物可还原Folin试剂中的磷钼酸和磷钨酸而产生钼酸和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于定量分析。

该蓝色复合物在745~750nm处有最大的吸收峰，可根据750nm的光吸收值计算蛋白质的含量。

该法灵敏度高，为5ug/ml~100ug.ml，但耗时长，干扰物质多，使蛋白质发生不可逆变性。

下图为Lowery检测蛋白质含量与吸光度的关系曲线。

1.3BCA（二喹啉甲酸）检测法

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。

而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。

1.4巯基测定检测法

含巯基化合物可以与DTNB（Ellman试剂）反应，断裂DTNB的二硫键产生2-硝基-5-硫代苯甲酸（NTB-），若在中性或碱性pH条件下的水中可以离子化，生成NTB2-二价阴离子。

这种NTB2-离子呈现黄色。

这个反应迅速且定量，加入1摩尔的巯基可以释放1摩尔的NTB。

通过测定在412nm可见光吸光度就可以定量NTB2-，进而计算巯基化合物含量（如谷胱甘肽GSH），或测定蛋白质上巯基基团的数目。

2.蛋白简单定性（分子量）

蛋白质分子量的简单定性是确定是否有蛋白质存在以及存在何种蛋白质，主要方法有：

SDS-PAGE、质谱（ESI-MS）、动态弹性光散射、沉降平衡超速离心、排阻层析（分子筛）。

2.1SDS-PAGE

SDS-PAGE法测蛋白质的相对分子量：

带电颗粒在电场中的迁移主要受三个因素的作用，即场强、颗粒本身的电荷及分子形状。

因此一般电泳无法直接测定蛋白质的分子量。

加入变性剂SDS后，蛋白质中的氢键和疏水键被破坏，蛋白质变性肽链伸展且蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖，使蛋白质所带负电荷远超过本身所有的电荷量，掩盖了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，同时还加入巯基乙醇破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质几乎成长椭圆棒状。

各种SDS蛋白复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷影响，而只与蛋白分子量有关。

下图左侧为几种常见蛋白质电泳迁移距离，右侧为未知蛋白质迁移距离，根据其相对其他蛋白质分子的迁移距离可算出该未知蛋白质的相对分子量。

2.2质谱（EMS-MS）

质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。

通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。

电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。

电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。

2.3动态弹性光散射

动态光散射，也称光子相关光谱 ，准弹性光散射，测量光强的波动随时间的变化。

动态弹性光散射仪器，可以用来测量大分子的分子量，故能用于蛋白质分子的定性分析。

动态光散射法用于测量粒度及分子大小。

DLS可测量作布朗运动颗粒的扩散情况，并采用斯托克斯-爱因斯坦方程转化为粒度与粒度分布，通过检测不同浓度下的粒径可以计算Kd，DLS相互作用因子。

2.4沉降平衡超速离心

沉降平衡超速离心是利用离心力的作用将分散体系中的分散质点逐渐沉降，质点越大，沉降速度越大，基于沉降速度与分子量依赖性的原理，来测定高聚物分子量分布的方法。

在高分子溶液中，高分子的质量很小，需要超速离心机，在很大的离心力场下才能观察到它们的沉降。

离心机转速可达1000r/s以上，得到几十万倍于重力的离心力。

如果在比沉降速度法低的转速和不可忽视溶质布朗运动的情况下继续离心，则由于离心力所引起的沉降与逆方向扩散相均衡，而使管内溶质的浓度分布保持一定。

这种状态就是沉降平衡。

通过平衡时的浓度分布分析可计算出溶质的分子量。

公式如下：

该分子不含水的相对分子重量；R：

气体常数；T：

绝对温度；S：

分子的沉降系数；ν：

分子的微分比容（当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积）；ρ：

溶剂的密度。

2.5排阻层析（分子筛）

排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

测定大分子的分子量是凝胶过滤的应用之一。

将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积也不同。

可根据洗脱体积求出柱的分配常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之间又存在线性关系，利用这一关系可绘制出Kav与分子质量的标准曲线。

蛋白质洗脱体积Ve与其分子量的关系如下：

lgMr＝K1－K2Ve

3.蛋白功能定性

蛋白功能定性是指确定蛋白质的特定功能，主要方法有蛋白序列定功能、蛋白质等温滴定、蛋白质荧光偏振、生物大分子相互作用仪。

3.1蛋白序列定功能

蛋白序列定功能指分解出特定蛋白的序列，然后比照蛋白序列得

出蛋白可能的各项功能。

首先是蛋白测序-Edman降解。

这种N端测序方法是通过Edman化学降解将蛋白质和多肽的N-端残基转化为PTH-氨基酸。

每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一步的降解，最后通过转移的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。

如下图：

将得到的蛋白质序列与蛋白质序列库PDB中特定功能序列对比，从而得出蛋白质功能。

3.2蛋白质等温滴定（ITC）

等温滴定量热技术是一种监测由结合成分的添加而起始的任

何化学反应的热力学技术，通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确的监测和记录一个变化过程的量热曲线，同时提供热力学和动力学信息，从而监测蛋白与蛋白相互作用过程中吸收和放出的热量，来确定蛋白结合功能。

3.3蛋白质荧光偏振

荧光偏振分析是指利用荧光偏振原理，通过检测荧光素所标

记的小分子与其他分子的相互作用前后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光偏振值作相关分析。

发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振光值低，从而计算出样品的偏振值。

故可以利用蛋白蛋白相互作用后，荧光偏振光的改变，来测定蛋白相互作用。

3.4生物大分子相互作用仪

表面等离子共振（SPR），当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于共振致使电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。

其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。

SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。

因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。

生物分子相互作用分析是基于SPR原理的新型生物传感分析技术，无须进行标记，也可以无须纯化各种生物组分。

在天然条件下通过传感器芯片实时、原位和动态测量各种生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖，以及病毒、细菌、细胞、小分子化合物之间的相互作用过程。

表面等离子共振是表面增强拉曼的重要增强机理之一，由于贵金属纳米粒子的尺寸效应及量子效应通过激发光照射能引起表面等离子共振，从而大大增强拉曼散射信号，已达到痕量检测的目的。