生物选修一53血红蛋白的提取和分离学案人教版.docx

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生物选修一53血红蛋白的提取和分离学案人教版

生物选修一5.3血红蛋白的提取和分离学案（人教版）

题3　血红蛋白的提取和分离1．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。

2．体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。

3．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。

蛋白质的各种特性的差异如分子的______和______、所带________________、溶解度、________和对其他分子的亲和力，等等，可以用分离不同种类的蛋白质。

一、凝胶色谱法

1．概念：

凝胶色谱法也称做__________，是根据____________的大小分离蛋白质的有效方法。

2．原理：

大多数凝胶是由________化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量____的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度______；而相对分子质量______的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在________移动，路程______，移动速度______。

相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3．凝胶材料：

______性，______类化合物，如葡聚糖或________。

4．具体过程：

（1）________混合物上柱。

（2）洗脱开始，______________的蛋白质______进入凝胶颗粒内；相对分子质量______的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。

（3）________________的蛋白质被滞留；__________________的蛋白质向下移动。

（4）相对分子质量不同的分子完全分开。

（）____________的蛋白质行程较短，已从________中洗脱出，________________的蛋白质还在行进中。

提示：

洗脱：

从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

二、缓冲溶液

1．作用：

在________内，能够抵制外界的________对溶液____的影响，维持____基本不变。

2．配制：

通常由________溶解于水中配制而成。

调节缓冲剂的______就可以制得在不同________使用的缓冲液。

三、电泳

1．概念：

带电粒子在______的作用下发生______的过程。

2．原理：

许多重要的生物大分子，如______、______等都具有________的基团，在一定pH下，这些基团会带上______或______。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷__________移动。

电泳利用了分离样品中各种分子__________以及分子本身的______、______不同，使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。

3．分类：

________凝胶电泳、__________凝胶电泳。

在测定蛋白质相对分子质量时通常使用__________________凝胶电泳。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带________的多少以及__________等因素。

而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生________，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会______成单条肽链，因此测定的结果只是________的相对分子质量。

同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于__________。

四、蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

________、粗分离、______和________。

1．样品处理及粗分离

血液由__________和__________组成，其中红细胞最多。

红细胞的组成中，除水分以外，约90%是__________。

血红蛋白由______条肽链组成，包括两条__________和两条__________。

其中每条肽链环绕一个__________基团，此基团可携带一分子氧或一分子__________。

血红蛋白因含有________而呈现____色。

（1）红细胞的洗涤

①目的：

去除________。

②方法：

采用________离心，如00r•in－1离心2in，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色______，将下层______的红细胞液体倒入______，再加入五倍体积的________，缓慢搅拌________，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有______，表明红细胞已洗涤干净。

（2）血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加________到________体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10in。

在________和________的作用下，红细胞______，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：

将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层（从上往下）：

第1层：

________的甲苯层。

第2层：

脂溶性物质的沉淀层——______薄层固体。

第3层：

________的水溶液——红色透明液体。

第4层：

其他杂质的________沉淀物。

将液体用______过滤，除去________________，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的________液体。

（4）透析：

取1L的________溶液装入________中，将其放入盛有300L的物质的量浓度为20l•L－1的__________中（pH为______），透析12h。

透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的，能使______自由进出，而将______保留在袋内。

透析可以去除样品中相对分子量较____的杂质，或用于更换样品的______。

2．纯化——凝胶色谱操作

处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等），因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。

第一步要制作__________。

第二步要__________________，因为____的凝胶和用________平衡好的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。

在装填凝胶柱时，不能有______存在。

第三步是样品的______和______。

3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断________的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

五、注意事项

1．红细胞的洗涤

洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。

洗涤次数过少，无法除去________；离心速度过高和时间过长会使________等一同沉淀，达不到分离的效果，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2．色谱柱填料的处理

商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在________中膨胀。

为了加速膨胀，可以将加入__________的湿凝胶用________加热，逐渐升温至接近沸腾。

这种方法不仅时间______，还能除去凝胶中可能带有的________，排除胶粒内的______。

3．凝胶色谱柱的装填

装填凝胶时要尽量________，从而降低颗粒之间的空隙。

不能有________存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的________，降低分离效果。

洗脱液不能______，露出凝胶颗粒，否则需重新装填。

4．蛋白质的分离

分离过程中，仔细观察________在洗脱过程中的移动情况。

如果色谱柱装填成功、分离操作正确，能清楚地看到红色区带狭窄、平整、均匀一致地随着洗脱液缓慢移动；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，与凝胶色谱柱的装填有关。

答案：

形状　大小　电荷的性质和多少　吸附性质

一、1分配色谱法　相对分子质量

2．多糖类　较小　较长　较慢　较大　凝胶外部　较短　较快

3．多孔　多糖　琼脂糖

4．

（1）蛋白质　

（2）相对分子质量较小　扩散　较大　（3）相对分子质量较小　相对分子质量较大　（）相对分子质量较大　层析柱　相对分子质量较小

二、1一定范围　酸和碱　pH　pH

2．1～2种缓冲剂　使用比例　pH范围内

三、1电场　迁移

2．多肽　核酸　可解离　正电　负电　相反的电极　带电性质不同　大小　形状　迁移速度

3．琼脂糖　聚丙烯酰胺　SDS—聚丙烯酰胺　净电荷　分子的大小　完全变性　解聚　单条肽链　分子的大小

四、样品处理　纯化　纯度鉴定

1．血浆　血细胞　血红蛋白　四　α肽链　β肽链　亚铁血红素　二氧化碳　血红素　红　

（1）杂蛋白　低速短时　血浆　暗红色　烧杯　生理盐水　10in　黄色　

（2）蒸馏水　原血液　甲苯　蒸馏水　甲苯　破裂　（3）无色透明　白色　血红蛋白　暗红色　滤纸　脂溶性沉淀层　红色透明　（4）血红蛋白　透析袋　磷酸缓冲液　70　小分子　大分子　小　缓冲液

2．凝胶色谱柱　装填凝胶色谱柱　干　缓冲液　气泡　加入　洗脱

3．纯化

五、1血浆蛋白　白细胞

2．洗脱液　洗脱液　沸水浴　短　微生物　空气

3．紧密　气泡　洗脱次序　流干

4．红色区带

1．血红蛋白分离的完整过程

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，分别是样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

不是所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的，蛋白质的和性质不同，分离方法差别很大。

提取血红蛋白的实验材料要选择哺乳动物血液，因为其红细胞中无细胞核，结构简单，血红蛋白含量高。

而提取DNA的实验材料要选择鸡的红细胞，因为其具有细胞核，含有DNA。

2．缓冲溶液

在一定范围内，能对抗少量外强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

缓冲溶液通常是由一种或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得的，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。

缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。

在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。

为了在实验室条下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。

实验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量，有利于杂质分子充分地向外扩散。

3．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的相对分子质量。

具体步骤如下：

（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；

（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备；（3）样品处理；（4）把凝胶固定于电泳装置上；（）加样：

按顺序加样，加样量通常为10～2μL，样品可以多加几个；（6）电泳；（7）剥胶；（8）染色；（9）脱色；（10）观察结果。

SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。

由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。

TEED和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。

因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤，在老师的指导下完成。

操作时要戴好一次性手套。

4．凝胶色谱操作中凝胶的装填

凝胶色谱操作中凝胶的装填要紧密、均匀。

凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。

相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。

因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等