印度药典内毒素.docx

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印度药典内毒素

2.2.3.BacterialEndotoxins

2.2.3细菌内毒素

Thetestforbacterialendotoxins（BET）measurestheactivityofbacterialendotoxinsthatmaybepresentinthesampleoronthearticletowhichthetestisappliedusingalysatederivedfromthehemolymphcellsoramoebocytesofthehorseshoecrab,Limuluspolyphemus.OtherspeciesofhorseshoecrabnamelyTachypleusgigas,TachypleustridentatusandCarcinoscropiusrotundicaudaalsoyieldamoebocytelysatehavingsimilaractivity.

细菌内毒素的实验来进行测量细菌内毒素的活度可以用样品或者文献上记载的血淋巴细胞或者蹄蟹的变形--鲎呈现。

其他种类的蹄蟹又叫做南方鲎，东方鲎和Carcinoscropiusrotundicauda，其溶血细胞具有相同的活性。

Theadditionofasolutioncontainingendotoxinstoasolutionofthelysateproducesturbidityorgelationofthemixture.However,additionofachromogenicsubstratetoasolutionofthelysateresultsindevelopmentofcolourduetoreleaseofchromophorefromthesubstrateuponactivation

bytheendotoxinpresentinthesolution.Therateofreactiondependsontheactivityofendotoxin,pHandtemperature.Thereactionrequiresthepresenceofcertainbivalentcations,aclottingcascadeenzymesystemandclottableprotein,allofwhichareprovidedbythelysate.

含有内毒素溶液的添加物到溶解产物中会产生浑浊或者凝结。

但是，除了显色底物添加到溶解产物来加深颜色外，从基质激活溶液中的内毒素也能引发发色团的释放。

反应的速度受内毒素的活性、pH和温度影响。

反应需要二价阳离子，一个凝血级联酶系统和凝固蛋白，一同出现在溶菌产物中。

ThefollowingmethodscanbeusedtomonitortheendotoxinconcentrationinaproductofficialinthePharmacopoeiaandtodeterminewhethertheproductcomplieswiththelimitspecifiedinthemonograph.

下列方法是药典里的方法，可以用来检测内毒浓度，裁定文献中的方法是否遵守专著的限值。

MethodA.Gel-ClotLimitTestMethod

方法A，凝胶限值测试方法

MethodB.Semi-quantitativeGel-ClotMethod

方法B，半定量凝胶法

MethodC.KineticTurbidimetricMethod

方法C，动态浊度法

MethodD.KineticChromogenicMethod

方法D，动力学显色方法

MethodE.End-PointChromogenicMethod

方法E，终点显色法

Whenamonographincludesatestforbacterialendotoxinswithoutmentioningamethod,thetestiscarriedoutbyMethodA.

当一个专论没有提到要用的检测内毒素的方法时，用方法A来检测。

Anyoneoftheotherfourmethodsmaybeemployedasanalternativemethodprovidedityieldsresultsofequivalentreliabilitywiththepreparationunderexamination.

其他四种方法可能用来作为可选的方法用来为已选的方法提供佐证。

ThequantitiesofendotoxinsareexpressedindefinedEndotoxinUnits（EU）.WiththeadoptionofthesecondInternationalStandardforendotoxinbytheExpertCommitteeonBiologicalStandardsoftheWorldHealthOrganization,1EU=1IU.

内毒素的量用内毒素单位EU来表示。

根据世界健康组织微生物标准委员会采用第二国际标准，1EU=1IU。

TheendotoxinlimitforagiventestpreparationiscalculatedfromtheexpressionK/M,whereMisthemaximumdoseAdministeredtoanadult（takenas70kgforthispurpose）perkgperhourandKisthethresholdpyrogenicdoseofendotoxinperkgofbodymass.ThevalueofKis5.0EUperkgforparenteralpreparationsexceptthoseadministeredintrathecally,andis0.2EUperkgforpreparationsintendedtobeadministeredintrathecally.

一个给定的准备测试内毒素的限量可以通过公式K/M来计算，M是执行一个成年个体每kg每h（70kg为目标）的最大浓度，K是每kg身体的致热临界值。

鞘内注射除外，注射用剂K的值是5.0EU/kg，鞘内注射K值为0.2EU/kg。

Forradiopharmaceuticalproductsnotadministeredintrathecally,theendotoxinlimitiscalculatedas175/V,whereVisthemaximumrecommendeddoseinml.Forintrathecallyadministeredradiopharmaceuticals,theendotoxinlimitisobtainedbytheformula14/V.Forformulations（anticancerproducts）administeredonapersquaremeterofbodysurface,theformulaisK/M,whereK=2.5EUperkgandMisthe（maximumdose/m2/hour*1.80m2）/70kg.

放射性药物产品不允许鞘内注射，内毒素限度为175/V，V是每毫升的最大推荐浓度。

放射药物允许鞘内注射，内毒素限度是根据公式14/V计算。

为了公式化（抗癌产品）人体表面每平方米，公式是K/M，K=2.5EU/kg，M是（最大浓度/m2/h*1.8m2）/kg.

Thetestshouldbecarriedoutinamannerthatavoidsendotoxincontamination.Ifnecessary,thecontainersshouldbetreatedtoeliminatesurfaceendotoxinsthatmaybepresentbyheatinginanovenat2500for30minutesprovidesmorethan3logreductionsorbyusingavalidatedovencycleorbyanyothermeans.

测试应当避免内毒素污染的方式进行。

如果有必要，容器应当多余3次在烘箱中250℃加热30分钟或者用经过验证的烘箱循环加热或者用其他途径来除去表面内毒素

Beforecarryingoutthetestforendotoxinsinthepreparationunderexaminationitisnecessarytovelify

在执行内毒素测试之前，有必要查证下列检查

（a）inthecaseofgel-clotmethods,thesensitivityofthelysate;

凝胶方法下，溶菌产物的敏感性

（b）inthecaseofquantitativemethods,thelinealityofthestandardcurve;

定量分析方法下，标准曲线的线性

（c）theabsenceofinterferingfactors,whichinhibitorenhancethereactionorotherwiseinterferewiththetestonthepreparationunderexamination;

缺少影响因素，禁止或者提高反应或者在准备试验下干扰试验

（d）theadequacyofthecontainerstoresistadsorptionofendotoxins..

充分抵制内毒素对于容器的吸附。

SpecialReagents

特殊试剂

Endotoxinreferencestandardandandcontrolstandardendotoxin.

内毒素参考标准和控制标准

TheEndotoxinReferenceStandard（ERS）isthefreeze-dried,purifiedendotoxinofEscherichiacoli055:

B5isusedastheControlStandardEndotoxinwhichiscalibratedinEndotoxinUnits（EU）bycomparisonwiththeInternationalStandard.

内毒素参考标准（ERS）是凝固干燥，大肠杆菌055:

B5的纯化内毒素通过对比国际标准的EU用作控制标准

TheEndotoxinReferenceStandard（ERS）oranyother'suitablepreparationtheactivityofwhichhasbeendeterminedinrelationtotheERSortheInternationalStandardusingagel-clotorothersuitablemethodismaintainedbyIndianPharmacopoeiaCommission,Ghaziabad.

内毒素参考标准（ERS）或者其他适当的与ERS有关的准备活动或者用凝胶或者其他适当的方法主要通过印度药典委员会加济阿巴德。

Thefreeze-driedendotoxinshouldbereconstitutedwithwaterBETbymixingintermittentlyfor30minutesusingavortexmixer.Theconcentrateshouldbestoredinarefrigeratorfornotmorethan28days.SubsequentdilutionsoftheconcentrateshouldbemadebymixingvigorouslyfornotlessThan5minutesbeforeuse.Eachdilutionshouldbemixedfornotlessthan1minutebeforeproceedingtomakethenextdilution.

冻干的内毒素应当与BET水用涡式混合器间歇混合30min进行重组。

浓缩应当储藏在冰箱（冷藏库）不得多于28天。

使用之前浓缩的稀释液应当充分混合不少于5min。

每次稀释在下一次稀释之前混合不得少于1min。

AControlStandardEndotoxin（CSE）whichissuitablystandardisedagainsttheERSmaybeusedforroutinebacterialendotoxintesting.

内毒素参考标准（ERS）适当的标准化可以用来常规细菌内毒素检测。

Lysate.Alysateofamoebocytesfromeitherofthespeciesofthehorseshoecrab,Limuluspolyphemus,Tachypleusgigas,TachypleustridentatusorCarcinoscorpiusrotundicaudareconstitutedasstatedonthelabel.Thespeciesfromwhichthelysateisobtainedisstatedonthelabel.

溶菌产物。

蹄蟹、马蹄蟹、南方鲎、中国鲎、圆尾鲎或者其中种属的变形细胞的溶菌产物，规定在标签上。

规定种属的溶菌产物列在标签上。

WaterBET.WaterBETispreparedbyasuitablemethodthatgivesanegativeresultundertheconditionsprescribedinthetestforbacterialendotoxinsonthepreparationunderexamination.

细菌内毒素检查用水。

检查用水通过一种特定的方法制备，在规定条件的检查中，细菌内毒素检查用水的细菌内毒素实验结果应呈阴性.

0.1MHydrocWoricacidBET.PreparefromhydrochloricacidusingwaterBET.AfteradjustmentofthepH6.0to8.0with0.1MsodiumhydroxideBETitgivesanegativeresultunder

theconditionsofthetest.

0.1mol盐酸（细菌内毒素实验）.用细菌内毒素检查用水稀释盐酸，用0.1mol氢氧化钠调整PH6.0到8.0。

测试条件下，结果应呈阴性。

0.1MSodiumhydroxideBET.PreparefromsodiumhydroxideusingwaterBET.MteradjustmentofthepHto6.0to8.0with0.lMhydrochloricacidBETitgivesanegativeresultundertheconditionsofthetest.

0.1mol氢氧化钠（细菌内毒素实验）.用细菌内毒素检查用水稀释氢氧化钠，用0.1mol盐酸调整PH6.0到8.0。

测试条件下，结果应呈阴性。

Tris-cWoridebufferpH7.4BET.Dissolve0.6057goftris（hydroxymethyl）methylaminein30mlofwaterBET,add0.33mlofhydrochloricacid,diluteto100mlwithwaterBETandmix.Itgivesanegativeresultundertheconditionsofthetest.

PH值7.4三氯化氨缓冲溶液（细菌内毒素实验）。

称取0.6057g三（羟甲基）甲胺溶解于30ml细菌内毒素检查用水中，加0.33ml盐酸用100ml细菌内毒素检查用水稀释并混合均匀。

测试条件下，结果呈阴性。

NOTE-Specialreagentsusedinthetestmayusethesuffix'LAL','TAL'or'CAL',asthecasemaybe,toindicatethespeciesofthehorseshoecrabfromwhichtheamoebocytelysateisderived.Theyhavethesamesignificanceasthesuffix'BET'.

注意：

实验中常用的特殊试剂也许会用“LAL”“TAL”“CAL”后缀，根据具体情况，来表明有生物鲎的血液变形细胞溶解物制的，它们和后缀“BET”一样有着相同的意义。

Gel-ClotMethods

MethodsAandBdependontheformationofafirmgelwhenasolutioncontainingbacterialendotoxinsisincubatedaftermixingwiththelysate.MethodAisconductedasalimittestwhereinboththereplicatesolutionsofthepreparationunderexaminationmustcontainendotoxinintheconcentrationlessthantheendotoxinlimitconcentrationspecifiedintheindividualmonograph.MethodBdeterminestheendotoxinconcentrationsemiquantitativelyinthepreparationunder

examination.

凝胶法

方法A和B都依靠溶液中包含的细菌内毒素与鲎试剂混合培养后是否有凝实的凝胶形成。

方法A是进行极限测试，其中准备重复的两个方案的检查中包含的细菌内毒素浓度必须少于指明的细菌内毒素极限浓度。

方法B确定细菌内毒素在半定量浓度下制备检查。

Sensitivityofthelysate.Confirmthelabelledsensitivityofeachnewbatchoflysatepriortouseinthetestusingatleastonevialofeachbatchoflysate.PrepareaseriesofdilutionsOfCSEtogiveconcentrationsof2λ,λ,0.5λand0.25λ,whereλisthelabelledsensitivityofthelysateinEUperml.PerformthetestasgivenunderMethodonthesefourstandardconcentrationsinduplicateandincludeAnegativecontrolconsistingwaterBET.Atleastthefinaldilutionineachseries

Mustgiveanegativeresult.

鲎试剂灵敏度。

确定每批新标示的灵敏度的鲎试剂每个小瓶中都有相应批次的鲎试剂。

准备一系列稀释浓度分别为2λ,λ,0.5λ和0.25λ，且标示的鲎试剂灵敏度单位为EU/ml。

在这四个标准下执行给定的测试方法：

浓度重复，包括用水来做的阴性对照，至少每个稀释级的最后一个浓度结果为阴性。

+=positive（gelclotpresent）;-=negative（gelclotabsent）

Calculatetheaverageofthelogarithmsofthelowestconcentrationofendotoxinineachseriesofdilutionsforwhichapositiveresultisfound.Thegeometricmeanend-pointconcentrationisthemeasuredsensitivityofthelysateinEUperml,whichiscalculatedusingthefollowingexpression:

计算每个稀释出现阳性结果的最低稀释浓度的对数的平均数。

用EU/ml来表示细菌内毒素灵敏度测试的几何平均数的重点浓度。

如下是计算过程：

Geometricmeanend-pointconcentration=antilog∑e/f）

where,∑e=sumofthelogend-pointconcentrationsoftheseriesofdilutionsused;

f=numberofreplicatetest-tubes.

Thisaveragegivestheestimatedlysatesensitivitywhichmust

liebetween0.5λand2λ.

几何平均数重点浓度=反对数（∑e/f）

∑e=所用的稀释级终点浓度的总数

f=重复实验次数

这给出的鲎试剂平均灵敏度必须间隔0.5λ和2λ

Testforinterferingfactors.Thepossibilityofinterferencewit