乳腺癌组织中BRMS1mRNA表达及意义.docx
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乳腺癌组织中BRMS1mRNA表达及意义
乳腺癌组织中BRMS1mRNA表达及意义
【摘要】 [目的]探讨BRMS1mRNA在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌临床病理特征的关系。
[方法]采用Trizol提取组织总RNA,将mRNA转录成cDNA,用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测乳腺组织BRMS1mRNA表达,以BRMS1mRNA和GAPDHmRNA含量的比值表示BRMS1表达水平。
[结果]乳腺癌组织中BRMS1mRNA的表达水平明显低于癌旁组织,也明显低于正常乳腺组织,BRMR1mRNA低表达与临床病理分期和淋巴结转移有关,而与患者年龄、癌肿大小、病理类型无关。
[结论]乳腺癌组织中BRMS1mRNA的低表达与乳腺癌的发展与转移有关,可能成为判断乳腺癌转移的一个标志物。
【关键词】乳腺肿瘤 BRMS1mRNA 实时荧光定量PCR
ExpressionofBRMS1mRNAinBreastCarcinomaandItsClinicalSignificance
Abstract:
[Purpose]ToinvestigateBRMS1geneexpressioninbreastcanceranditsclinicalsignificance.[Methods]TotalRNAwasextractedwithTrizol.mRNAwastranscribedreverselyintocDNA.BRMS1wasdetectedwithRFQ-PCR.BRMS1geneexpressionwerepresentedastheratiosofBRMS1mRNAtoGAPDHmRNA.[Results]BRMS1expressionincancertissuewassignificantlylowerthanthatinpara-canceroustissueandinnormaltissue是新近发现的一个乳腺癌肿瘤转移抑制基因,定位于人染色体~[1]。
将其转染到乳腺癌细胞株MDA?
鄄MB?
鄄435和MDA?
鄄MB?
鄄231中,可降低其转移潜能。
目前有关BRMS1基因的研究仍停留在体外研究水平上。
我们采用实时荧光定量PCR技术对乳腺癌组织进行BRMS1mRNA检测,探讨乳腺癌转移的细胞特征及转移检测指标的应用价值。
1材料与方法
一般资料
2003年3月~2005年4月,我院收治的乳腺癌患者51例,年龄31岁~62岁,平均年龄岁,其中浸润性导管癌23例,单纯癌14例,腺癌4例,黏液腺癌2例,乳腺癌有淋巴结转移的35例,未转移16例;乳腺良性疾病25例,年龄26岁~55岁,平均岁,其中纤维瘤18例,小叶增生病4例,导管内乳头状瘤3例。
患者术前均未进行放疗及化疗。
标本收集
对每例乳腺癌手术患者均取癌组织及癌旁组织,并取25例乳腺良性疾病病变组织周围的正常组织作为对照,取材后立即用锡纸包裹并标记好,放入液氮中保存备用。
定量测定BRMS1mRNA表达
主要仪器
ABIPRISM7000荧光定量PCR分析仪,核酸测定仪:
Biophotometer(Eppendorf公司)。
主要试剂
TrizolRNA提取试剂盒,M?
鄄MLVcDNA合成试剂盒,PCR反应试剂,RNase?
鄄free试剂,以上试剂由上海生工提供,BRMS1及3?
鄄磷酸甘油醛脱氢酶RT引物,荧光定量PCR引物,荧光探针及用来制作标准曲线的人工合成BRMS1及GAPDHcDNA均购自上海基康生物技术有限公司。
引物序列
BRMS1上游引物:
5'?
鄄GACCGCCAGAGCCTGGA?
鄄3',下游引物:
5'?
鄄CTGCCTCTGGCGTGCAGT?
鄄3',荧光探针:
5'?
鄄FAM?
鄄CAGCTCTGAATGGTGG?
鄄MGB?
鄄3'。
GAPDH上游引物:
5'?
鄄CCATCAATGACCCCTTCATTG?
鄄3',下游引物:
5'?
鄄CATGGGTGGAATCATATTGGAAC?
鄄3',荧光探针:
5'?
鄄VIC?
鄄CCTCAACTACATGGTTTAC?
鄄MGB?
鄄3'。
实验步骤
RNA提取:
Trizol法提取组织总RNA,核酸蛋白紫外分析仪检测RNA质量和浓度。
RT反应:
用M?
鄄MLVcDNA试剂盒进行RT反应,取总RNA2μg,加μg/μloligo?
鄄dT引物1μl,用RNase?
鄄free水定容12μl,5×RTbuffer4μl,20U/μlRNaseInhibitor1μl,10mmol/LdNTPs2μl,20U/μlM?
鄄MLV反转录酶1μl,终体积20μl。
37℃60min,70℃10min反应结束,-20℃保存。
定量PCR:
20μl反应体系,内含BRMS1或GAPDHcDNA模板2μl,10×buffer2μl,10mmol/LdNTPs1μl,25mmol/LMgCl22μl,10μmol/LBRMS1或GAPDH上下游引物各μl,5μmol/LBRMS1或GAPDH荧光探针1μl,TagDNA聚合酶1μl,蒸馏水6μl。
反应条件:
50℃2min激活UNG,95℃预变性2min,94℃15s,60℃60s,40个循环。
结果计算
根据荧光定量PCR的反应曲线判断标本达到循环阈值时的循环数,Ct与该标本起始浓度的对数存在线性关系,根据标准曲线求出BRMS1mRNA及GPDAHmRNA含量,两者比值即为BRMS1相对表达量。
统计学处理
应用软件进行统计分析,组间比较用t检验。
2结果
BRMS1mRNA在乳腺癌组织中的表达
乳腺癌组织为±,癌旁组织为±,正常组织为±,乳腺癌组织中BRMS1mRNA表达显着低于正常乳腺组织,也显着低于癌旁组织。
BRMS1mRNA表达与临床病理特征关系
见表1。
BRMS1mRNA的低表达与TNM分期及淋巴结转移有关,而与患者年龄、肿瘤大小、病理类型无关。
3讨论
在肿瘤发生至转移的演进过程中存在大量遗传学改变,这种细胞本身的DNA发生变化构成了肿瘤转移的分子基础,1996年,PhillipsKK等发现将11号染色体导入乳腺癌细胞株MDA?
鄄MB?
鄄435,则此细胞的转移能力显着降低,而不影响其致瘤性,说明有一个或多个肿瘤转移抑制基因定位于人11号染色体上。
2000年,SerajMJ等[1]用差异显示反转录PCR及染色体定位技术将此基因克隆并定位于染色体~,命名为BRMS1。
核酸序列分析证明BRMS1与其它基因无同源性,是一个新的基因,它编码一个有246个氨基酸、分子量约28500道尔顿的新的蛋白质。
研究表明具有高度转移潜能的恶性肿瘤细胞,一般表现为BRMS1表达降低成缺失,将BRMS1转染到这些细胞中,可抑制其转移潜能,Samant等将BRMS1cDNA转染到乳腺癌细胞株MDA?
鄄MB?
鄄435和MDA?
鄄MB?
鄄231后其生长和局部浸润影响不大,但癌细胞转移潜能明显降低,再将此两种细胞及未转染BRMS1的细胞分别注入小鼠乳腺组织中,两组比较,转染BRMS1的细胞可在局部生长形成肿瘤,但很少发生肺转移及淋巴结转移,说明BRMS1可以抑制乳腺癌转移。
以上结论均来自细胞株及动物实验,BRMS1在乳腺组织中表达情况如何未见报道。
本研究结果表明:
在人乳腺癌组织中,BRMS1mRNA表达降低,BRMS1mRNA的低表达与患者年龄、肿瘤大小、病理类型无关,而与TNM分期及淋巴结转移有关,说明BRMS1基因在肿瘤转移中起抑制作用,提示癌组织中BRMS1mRNA水平可作为监测肿瘤转移的一个指标,为乳腺癌的综合治疗及预后判断提供了依据。
目前乳腺癌是否转移一般由病理结果判断,而淋巴结阴性乳腺癌患者中仍有约30%发生转移,组织中BRMS1mRNA水平能否作为乳腺癌微转移的标志还有待于进一步试验及对术后患者的观察随访。
虽然BRMS1基因的肿瘤转移抑制作用被证实,但其作用机制仍不十分清楚,BRMS1抑制乳腺癌转移的机制可能与细胞间缝隙连接、信号传导有关。
Saunders等将BRMS1cDNA转染到乳腺癌细胞系MDA?
鄄MB?
鄄435中,发现转染BRMS1基因后恢复了缝隙连接蛋白亚基CX43的表达,恢复的缝隙连接表型与正常乳腺细胞相似,说明BRMS1基因使CX43表达上调,恢复癌细胞与正常组织细胞间缝隙连接及信号传导,抑制癌细胞脱离原发灶而发生转移。
免疫共沉淀和酵母双杂交试验显示,BRMS1能与视网膜母细胞瘤结合蛋白1及mSin3组蛋白脱乙酰化酶复合体相互作用,抑制转录过程。
恶性肿瘤转移过程中基因表达下调或缺失一般有几个原因:
基因突变、杂合性缺失、甲基化等,BRMS1基因表达下调或缺失是哪种原因引起,还有待进一步研究。
【参考文献】
[1]SerajMJ,SamantRS,VerderameMF,etal.Functionalevidenceforanovelhumanbreastcarcinomametastasissuppressor,BRMS1,encodedatchromosome11q13[J].CancerRes,2000,60:
2764-2769.
SamantRS,DebiesMT,ShevdeLA,etal.Identificationandcharacterizationofthemurineortholog(brms1)ofbreastcancermetastasissuppressor1(BRMS1)[J].IntJCancer,2002,97:
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PhillipsKK,WelchDR,MieleME,etal.SuppressionofMDA?
鄄MB?
鄄435breastcarcinomacellmetastasisfollowingtheintroductionofhumanchromosome11[J].CancerRes,1996,56:
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SamantRS,SerajMJ,SaunderMM,etal.AnalysisofmechanismsunderlyingBRMS1suppressionofmetastasis[J].ClinExpMetastasis,2000,18:
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MeehanWJ,SamantRS,HopperJE,etal.Breastcancermetastasissuppressor1(BRMS1)formscomplexeswithretinoblastoma?
鄄bindingprotein1(RBP1)andthemSin3histonedeacetylasecomplexandrepressestranscription[J].JBiolChem,2004,279:
1562-1569.
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- 乳腺癌 组织 BRMS1mRNA 表达 意义