浙科版生物选修1讲义第1部分实验1 大肠杆菌的培养和分离.docx
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浙科版生物选修1讲义第1部分实验1大肠杆菌的培养和分离
实验1
大肠杆菌的培养和分离
课 标 解 读
重 点 难 点
1.进行大肠杆菌的扩增,利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2.进行大肠杆菌的分离,用固体平面培养基进行细菌的划线培养。
3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
1.微生物实验的无菌操作。
2.利用LB液体培养基进行细菌培养。
3.利用LB固体培养基分离大肠杆菌。
4.划线分离法和涂布分离法。
一、大肠杆菌
1.大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
2.在肠道中,大肠杆菌一般对人无害,但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素,任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统,都会对人体产生危害。
3.大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。
二、实验内容
1.本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。
分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
2.本实验用LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。
培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离,随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。
三、细菌的培养和分离
1.细菌以分裂的方式繁殖,分裂速度很快,约20分钟分裂一次。
人们在培养细菌时,一般用接种环转移带菌的培养物。
接种时,先将接种环在明火上烧红后冷却,再操作。
2.细菌的分离
(1)划线分离法:
在液体培养基中,只要接种后培养8h,每毫升培养基中就有几亿个细菌。
可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少,因此,划线到最后,可使细菌间的距离加大。
在固体培养基培养10~20h后,可由一个细菌产生单菌落,菌落不会重叠。
如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上,在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。
这种方法也可用于分离细菌,将污染的杂菌除去。
接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么?
【提示】 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物;除第一次划线外,其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种;取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行,目的是防止高温杀死菌种;最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
(2)涂布分离法:
先将培养的菌液稀释,通常稀释10-5~10-7倍,然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落。
通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。
将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后,再做功能性实验。
细菌的两种分离法各有优点,都可采用。
划线分离法,方法简单;涂布分离法,单菌落更易分开,但操作复杂些。
四、灭菌操作
1.各种器皿必须是无菌的:
实验用具用牛皮纸或报纸包好,所有容器都先封口,然后进行高压蒸汽灭菌(1kg/cm2压力、121℃、15min)处理,并在超净台上使用。
注意:
实验中所需棉花不能用脱脂棉,因为脱脂棉易吸水。
2.各种培养基必须是无菌的。
3.细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。
注意:
培养皿需倒置,防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基,冲散菌落。
五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤
1.在两个250mL三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基,加上封口膜。
将培养皿包好,连同培养基一同灭菌15min。
2.灭菌后待培养基冷却至60℃时,关闭紫外灯,点燃酒精灯,并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。
在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶,左手拿培养皿,并将培养基倒入4个培养皿中,将培养皿置于水平位置上,待其凝固。
为什么要在酒精灯火焰旁进行操作?
【提示】 酒精灯火焰旁约10cm的空间是一个无菌区,在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。
3.扩大培养
先将接种环在酒精灯火焰上烧红,再深入到大肠杆菌斜面,使环冷却后,取菌体,并将菌体放入三角瓶液体培养基中,封瓶后在37℃每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
4.划线分离
用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中,然后在固体培养基的平板上连续划线,接种环需蘸菌液1次,划线后盖好皿盖,将培养皿倒置,在37℃,恒温培养箱中培养12~24h后,可在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。
5.在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在斜面上,37℃培养24h后,置于4℃冰箱中保存。
微生物培养的基本条件
1.培养基及其类型
(1)培养基:
①概念:
人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质,此即培养基。
②作用:
在提供主要营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求,如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素,培养霉菌时需将pH调至酸性,培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。
(2)培养基的种类
划分标准
培养基种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
微生物的扩大培养、工业生产
半固体培养基
加凝固剂,如琼脂
观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
用途
选择培养基
培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素;培养金黄色葡萄球菌,可在培养基中加入高浓度食盐)
用途
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物,如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
2.无菌技术
进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染,无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开,主要包括以下几个方面:
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
3.消毒和灭菌的比较
概念
常用方法
应用的范围
消毒
使用较为温和的物理或化学方法,杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法:
在100℃开水中煮沸5~6min
一般物品
巴氏消毒法:
70~75℃煮30min或在80℃煮15min
对于一些不耐高温的液体,如牛奶
化学药剂消毒法
如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)
灼烧灭菌:
酒精灯火焰
接种工具的灭菌
干热灭菌:
干热灭菌箱内160~170℃下灭菌1~2h
玻璃器皿、金属工具的灭菌
高压蒸汽灭菌:
121℃条件下,灭菌15~30min
培养基及容器的灭菌
注:
消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活
某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。
实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。
请回答与此实验相关的问题。
(1)制备培养基:
根据物理性质的不同,可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。
对细菌进行大量的扩增,用________培养基进行培养;对细菌进行分离,用________培养基进行培养。
(2)灭菌:
在培养微生物时必须进行无菌操作,包括各种________都必须是无菌的。
对它们进行灭菌,通常用________法灭菌。
(3)接种及培养:
接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。
为了尽快观察到细菌培养的实验结果,应将接种了湖水样品的平板置于________中培养,培养的温度设定在37℃。
要使该实验所得结果可靠,还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。
(4)菌落观察计数:
培养20小时后,观察到平板上有形态和颜色不同的菌落,这说明湖水样品中有________种细菌。
一般说来,菌落总数越多,湖水遭受细菌污染的程度越________。
(5)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。
如果提高培养基中NaCl的浓度,可以用于筛选耐________细菌。
【思路点拨】
(1)细菌扩大培养用液体培养基,分离用固体培养基。
(2)无菌操作包括所有的器皿要无菌,所有的培养基要无菌,接种过程要防止杂菌污染。
实验室中常用高压蒸汽灭菌法。
(3)接种时常用接种环,用恒温培养箱保持温度。
在实验过程中,除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同,以利于更好地实现实验目的。
(4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、颜色、透明度、光滑度等。
)(5)选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
【答案】
(1)液体 固体平面
(2)器皿和培养基高压蒸汽灭菌 (3)接种环 恒温培养箱 无菌水(4)多 高 (5)盐(或NaCl)
1.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理,这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A.接种环、手、培养基B.高压锅、手、接种环
C.培养基、手、接种环D.接种环、手、高压锅
【解析】 此题考查对无菌技术的掌握。
高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备,通常用于培养基的灭菌。
用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。
火焰灼烧,可以迅速彻底地灭菌,适用于微生物接种工具的灭菌,如接种环。
【答案】 C
大肠杆菌的培养和分离
1.LB培养基的制备
(1)计算:
根据LB培养基配方的比例,计算配制50mL的培养基时各种成分的用量。
(2)称量:
准确地称取各种成分。
即:
蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g,加水50mL。
(如配LB固体培养基,则再加1g琼脂)
(3)制备空白斜面:
将LB液体培养基配好,加入琼脂并加热使之融化后,通过玻璃漏斗加入试管中,每试管2mL,加棉塞并将试管捆在一起,上端加盖一张牛皮纸,灭菌。
灭菌后斜靠于平放的铅笔上,冷却后即成空白斜面培养基。
2.进行大肠杆菌培养与分离操作
(1)灭菌
(2)制备LB固体平面培养基——倒平板操作
待培养基冷却至60℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板的具体操作描述如下:
(3)扩大培养
①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶,右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。
②将接种环在火焰上烧红,再深入到斜面,使其冷却后取菌体。
③将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。
④三角瓶在37℃摇床振荡培养12h。
(4)划线分离
①取种
在酒精灯火焰上灼烧接种环,将上述培养后的菌液打开,接种环部分深入到菌液中取种。
②平板划线操作
在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示),划线后盖好培养皿。
③培养
将上述划线操作后的培养皿倒置放至37℃恒温培养箱中培养12~24h,可看到划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。
(5)菌种纯化与保藏
在无菌操作下,将单菌落用接种环取出,再用划线法接种至斜面上,37℃培养24h后,4℃冰箱保存即可。
划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面,以期在连续划线后,可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落),从而达到纯化菌种的目的,为此,在划线操作时,接种环只需在菌液中蘸取菌液一次,且作第二次及其以后的划线操作时,须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少,并逐步分散,最终实现在平板上得到单菌落的目的。
下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程:
→
→
→
→
请回答:
(1)灭菌常用________法,灭菌后,要待________________时才能打开锅盖。
(2)倒平板和接种前要用________擦手。
接种和划线前使用________的方法对接种环灭菌。
(3)划线分离时,接种环在菌液中蘸取________次。
下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线,请在乙图中画出第三次划线。
(4)划线后在恒温培养箱中培养时,培养皿须倒置,目的是__________________。
(5)实验完成后,接触过细菌的器皿应如何处理?
____________________。
【思路点拨】 此题考查大肠杆菌的培养和分离过程,具体分析如下:
(1)灭菌是指对LB液体培养基和LB固体培养基进行的灭菌。
对培养基进行的灭菌应该是用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。
灭菌后,灭菌锅内的压力与大气压相同时,才能打开灭菌锅,否则会造成培养液溅出。
(2)在进行实验操作时,操作者的双手要用酒精棉球擦拭消毒,接种环要用火焰烧灼灭菌。
(3)划线分离时,接种环在菌液中蘸取菌液1次然后连续划线。
(4)在培养时,培养皿须倒置,目的是防止冷凝后形成的水滴落在培养基上污染培养基,冲散菌落。
(5)实验完成后,接触过细菌的器皿应灭菌处理以防止污染。
【答案】
(1)高压蒸汽 灭菌锅内压力与大气压相同
(2)酒精棉球 (酒精灯火焰上)灼烧
(3)1 (见右图)
(4)避免水滴污染培养基
(5)接触过细菌的器皿应作灭菌处理
划线分离操作
①第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌,划线操作结束仍需灼烧接种环,每次灼烧的目的如下表:
第一次灼烧
每次划线之前灼烧
划线结束灼烧
目的
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种,使每次划线的菌种来自上次划线末端
杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者
②灼烧接种环之后,要冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。
③划线时最后一区域不要与第一区域相连。
④划线用力要大小适当,防止用力过大将培养基划破。
2.下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程,请回答:
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→
→
→
(1)A过程配制的是通用细菌培养基,称为________培养基。
配制时除了加入特定的营养物质以外,还要加入一定量的氯化钠,以维持________。
对培养基酸碱度的调节,应该在B过程的________(填“前面”或“后面”)。
(2)D过程与C过程相比,培养基中增加的物质是________。
E过程所需的温度是________。
(3)D过程后,一个菌体便会形成一个________,这种分离方法是________________的通用方法,也是筛选特定菌株的最简便方法之一。
【答案】
(1)LB 渗透压 前面
(2)琼脂 4℃
(3)(单)菌落 消除污染杂菌(纯化菌种)
1.下列有关倒平板操作错误的是( )
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.将培养皿打开,培养皿盖倒放在桌面上
D.等待平板冷却凝固后需要将平板倒过来放置
【解析】 整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵,因此,灭过菌的培养皿放在火焰旁,打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰,培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,不能将培养皿盖完全打开,等待平板冷却凝固后需要将平板倒过来放置。
【答案】 C
2.无菌技术包括以下几个方面的叙述,其中错误的是( )
A.对培养操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B.对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C.为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
【解析】 灭菌是采用强烈的理化因素对用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基进行处理,使物体内外一切微生物,包括芽孢和孢子都要被杀死;实验操作者的衣着和手以及操作空间只能进行消毒。
【答案】 A
3.下列依次表示倒平板、接种的位置,以及划线法接种的路径示意图,其中错误的是( )
【解析】 在划线时,应在第一区的划线末端开始往第二区域内划线,在第二区的划线末端开始往第三区划线。
【答案】 D
4.关于大肠杆菌的培养和分离实验以下叙述不正确的是( )
A.本实验的内容是将大肠杆菌进行扩大培养和划线分离
B.本实验用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌,再在LB固体平面培养基上划线进行大肠杆菌的分离
C.除划线分离外,也可用涂布分离法分离大肠杆菌,两种分离方法中划线分离方法简单且单菌落更易分开
D.进行培养之前对加入培养基的三角瓶、试管也要在121℃下灭菌15min
【解析】 划线分离与涂布分离均可实现对大肠杆菌的分离,其中划线分离法操作简单,但单菌落相对不易分开,涂布分离法操作虽相对复杂,但单菌落更易分开。
【答案】 C
5.微生物与人类关系密切。
虽然有些微生物能使动植物患病,但多数微生物对人类是有益的。
请回答:
(1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供____________。
对培养基进行灭菌,应该采用的方法是____________。
接种时通常采用________法。
(2)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时,平板冷凝后,要将平板倒置的原因是____________________________________________________
____________________________________________________________。
(3)微生物接种的方法很多,最常用的是平板划线法和____________法。
在用平板划线法接种时,在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的目的是______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________________________________________________________。
在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗?
为什么?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________________________________________________________。
【答案】
(1)氮源(碳源)、碳源 高压蒸汽灭菌 平板划线
(2)皿盖上会凝有水珠,防止水珠落入培养皿造成污染,还可使培养基表面的水分更好地挥发
(3)稀释涂布平板
第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种,使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端,以便通过多次划线后,得到单个的菌落 划线结束后仍要灼烧接种环,以免菌种对环境造成污染和感染操作者
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