细胞培养基本技术.docx
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细胞培养基本技术
细胞培养基本技术
细胞培养的甚本概念
传代:
细胞在培养器皿中生长一定时间后,被分开接种到新的培养器皿中.
原代培养
取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养.
细胞培养:
使用单个细胞悬液
组织培养:
使用组织块(O.5~1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)
器官培养:
使用器官原基或器官的一部分或整个器宫
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期
传代期
衰退期
有限细胞系,无限细胞系
细胞系cellline
细胞株cellstrain
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长:
必须贴附于支持物表面才能生长.见于各种实体瘤细胞
悬浮生长:
于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面.见于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期
贴壁期
潜伏期
对数生长期
停止期(平台期)
游离期:
细胞接种后在培养液中呈悬浮状态.也称悬浮期.此时细胞质回缩,胞体呈圆球形.
10分钟一4小时
贴壁期:
细胞附着于底物上,游离期结束.细胞株平均在10分钟一4小时贴壁.
底物:
胶原,玻璃,塑料,其它细胞等
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素,胶原等糖蛋白(生长基质),这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着.
进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基团)
潜伏期
此时细胞有生长话动,而无细胞分裂.细胞株潜伏期一
般为6~24小时.
对数生长期:
细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究.
停止期(平台期):
细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂
机制:
接触抑制,密度依赖性
培养细胞生长的条件
1细胞的营养需要
2细胞的生存环境
温度:
37℃
O2
CO2:
5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-
pH:
7.2-7.4
渗透压
3无污染
4无毒
实验准备
实验用品:
超净工作台,压力蒸汽消毒器,电热干燥箱,滤器,酸缸
CO2培养箱
倒置显微镜
酶标仪,微孔板震荡器
液氮罐
自动双重纯水蒸馏器,纯水仪
耗材:
培养瓶,吸管,电动吸引器,培养板,冻存管
压力蒸汽消毒器:
湿热消毒,用途广
电热干燥箱:
干热消毒(160℃,2小时).主要用干玻璃
器皿消毒
滤器:
过滤除菌:
大多数培养用液,如人工合成培养基,血清,
酶液等均采用滤过法除菌
超净工作台:
为细胞操作提供无菌环境
紫外灯:
紫外线消毒.主要用于培养室空气,操作台,塑料
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化.净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境.
滤器
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃,5%CO2.
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题:
①用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气.
②保持培养箱内空气干净.定期消毒
(90℃,14h).
③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度,避兔培养液蒸发.
自动双重纯水蒸馏器纯水仪
酶标仪微孔板震荡器
培养板
培养瓶
常用玻璃器皿清洗
浸泡(自来水),刷洗(洗衣粉),酸泡(24小时),
流水冲洗,蒸溜水浸泡和冲洗,50℃烘干
清洁液的配制
2细胞培养用液的配制
水:
新鲜配置的三蒸水或去离子水
平衡盐溶液:
无Ca2+,Mg2+的缓冲液
PBS:
NaCl8.0g
KCl0.2g
Na2HPO4.H2O1.56g
KH2PO40.20
加水至1000ml
消化液:
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离.
胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞.
胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+,Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%.用滤器过滤除菌.
胰蛋白酶液消化时间:
2-10分钟.
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
培养基
培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基.
天然培养基:
天然培养基有血清,血浆,和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液).
优点:
营养成分丰富,培养效果好
缺点:
来源受限.
成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析.
易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的.目前已设计出许多种培养基,如TC199,MEM,RPMI-1640,DMEM等.
合成培养基主要成分是氨基酸,维生素,碳水化合物,无机盐和其它一些辅助物质.
优点:
标准化生产,组分和含量相对固定.
成本低
缺点:
缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要.
人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清).
血清中含有:
①多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等)
②多种金属离子
;③激素;
④促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白,胶原等.
⑤各种生长因子
⑥转移蛋白
⑦不明成分
一般说来.含5%小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死.但支持细胞生长一般需加10%血清.
对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明,但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚.
血清中不仅存在促细胞生长因子,同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子,因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应.
在生长因子,蛋白质工程,基因表达调控等研究领域,迫切需要用无血清培养基培养细胞.
无血清培养基的主要研制策略:
在基础培养基中补充各种必需因子,如激素,生长因子,结合蛋白,贴壁和扩展因子等.
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成.
1975年,Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株,近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖.
无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性,可重复性和稳定性,,减少了细胞污染,简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序.
向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的.适用于某种细胞株的培养液,很可能不适合另一种细胞株的生长.即使同源组织的不同细胞株,所需补加物也不同.
无血清培养基尚处于研究阶段,难以推广.
目前,绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清
血清质量好坏是实验成败的关键.
常用血清有胎牛血洁,新生牛血清,小牛血情,兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好.
优质血清的标准:
透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌,支原体,病毒污染.
血清的灭活(消除补体活性):
56℃,30分钟
血清的消毒:
过滤除菌
抗菌素的使用:
在培养液配制后,培养液内常加适量抗菌素,以抑制可能存在的细菌的生长.
通常是青霉素和链霉素联合使用.培养基内青霉素,链霉素最终使用浓度为每毫升100单位.
庆大霉素:
每毫升100单位——方便,广谱,稳定
完全培养基的组成
基础培养基80%一95%
血清5%一20%
碳酸氢钠2.0g/L
青,链霉素各100卑位/毫升
培养基的配制
RPMI-1640培养粉1袋
碳酸氢钠2.0g
青,链霉素各100单位/毫升
加三蒸水至1000ml,过滤除菌.
调节pH值至7.2
加血清(终浓度10%)
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点,传代方法有3种.
1悬浮生长细胞传代
离心法传代:
离心(1000转/分)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代.
直接传代法:
悬浮细胞沉淀在瓶壁时,将上清培养液去除l/2一2/3,然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代.
2半悬浮生长细胞传代(Hela细胞)
此类细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹
打法使纫胞从瓶壁脱落下来,进行传代.
3贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代.常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液.
贴壁生长细胞传代方法:
1吸光培养瓶中的培养液
2加入1-2ml0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)
静置2-10min(显微镜下动态监测).
3吸去胰蛋白酶液,加入培养液.
4用吸管吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,形成细胞悬液.
5吸取1/10—1/40细胞悬液,接种于新的培养瓶内.
6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内.
7将后者放入培养箱中培养.
细胞计数
血细胞计数器:
手工计数细胞
Coulter计数仪:
人工计数
培养细胞活力测定
细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一._
任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成,从形态上区别死,活细胞是困难的.
1细胞克隆形成率实验
单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆.克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力
克隆形成率比=克隆形成数/接种细胞数
缺点:
操作繁琐
优点:
精确,可靠
2台盼蓝法
活细胞不被染色,死细胞染成蓝色,用活细胞占
细胞中的百分比表示细胞恬力
已淘汰
3四唑盐(MTT)比色法
四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝,
四吐盐比色法的原理:
活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能.二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比.再用酶标仪测定OD值
MTT法简单快速,准确,广泛应用于新药筛选,细胞毒牲试
验,肿瘤放射敏感性实验等.
操作步骤
(1)单细胞悬液接种于96孔培养板;103-104细胞/孔,每孔培养基总量200微升(96孔培养板每孔容积370微升),37℃,5%
CO2培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)
(2)加入2毫克/毫升的MTT液(50微升/孔);继续培养3小时.
(3)吸出孔内培养液后,加入DMSO液(150微升/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟,使结晶物溶解.
(4)酶标仪检测各孔OD值(检测波长570纳米).记录结果,绘制
操作步骤
(1)单细胞悬液接种于96孔培养板;103-104细胞/孔,每孔培养基总量200微升(96孔培养板每孔容积370微升),37℃,5%
CO2培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)
(2)加入2毫克/毫升的MTT液(50微升/孔);继续培养3小时.
(3)吸出孔内培养液后,加入DMSO液(150微升/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟,使结晶物溶解.
(4)酶标仪检测各孔OD值(检测波长为570nm).记录结果,绘制细胞生长曲线
细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作.细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力,经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化.
冻存和复苏的原则:
慢冻快融
当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:
细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶.
如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反.结晶就大,大结晶会造成细胞膜,纲胞器的损伤和破裂.复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶.
慢冻程序
标准程序:
当温度在-25℃以上时,1~2℃/min
当温度达-25℃以下时,5~10℃/min
当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中
细胞冻存器
简易程序:
将冷冻管(管口要朝上)放入纱布袋内,纱布袋系以线绳,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口,按每分钟温度下降1~2℃的速度,在40分钟内降至液氮表面,停30分钟后,直接投人液氮中.
低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果.
常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤.
细胞冻存方法
1预先配制冻存液:
含20%血清培养基
10%DMSO
2取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1×106~5×106细胞/ml)
3加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期.
4年后,存洁率可达80%一叽%.DMSO液用培养液配好,
避免因临时配制产热而伤害细胞.对人造血干细胞的研究证
细胞复苏方法
(l)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37~38℃水浴中,使其融化(1分钟左右).
(2)5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上.
(3)低速离心10分钟.
(4)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞.
1:
培养液pH值变化太快
可能原因
(1)CO2张力不对
(2)培养瓶盖拧得太紧
(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足
(4)培养液中盐浓度不正确
(5)细菌、酵母或真菌污染
建议解决方法
(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度,2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液,在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物,或用抗生素除菌。
问题2:
培养液出现沉淀,但pH值不变
可能原因
(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐,将培养基成分沉淀下来
(2)冰冻保存培养液
建议解决方法
(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿,然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃,摇动使其溶解如沉淀仍然存在,丢弃培养液。
问题3:
培养液出现沉淀,同时pH发生变化
可能原因
细菌或真菌污染
建议解决方法
丢弃培养物,或用抗生素除菌。
问题4:
培养细胞不贴壁
可能原因
(1)胰蛋白酶消化过度
(2)支原体污染
(3)培养瓶瓶底不干净
(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)
(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当
细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)
(7)接种细胞起始浓度太低或太高
建议解决方法
(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物,检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染,丢弃培养物。
(3)注意刷洗,或换用一次性塑料培养瓶
(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)
(5)重新配置消化液或培养液
启用新的保种细胞
(7)调节最佳接种细胞浓度
问题5:
悬浮细胞成簇
可能原因
(1)培养液中含钙、镁离子
(2)支原体污染
(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释
(4)DNA污染
建议解决方法
(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞,轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
(2)分离培养物,检测支原体。
如发现支原体污染,丢弃培养物。
(3)用DNaseI处理细胞。
问题6:
原代细胞培养物污染
可能原因
原代培养组织在进入培养前已污染
建议解决方法
培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
问题7:
培养细胞生长减慢
可能原因
(1)由于更换不同培养液或血清
(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
(3)培养物中有少量细菌或真菌污染
(4)试剂保存不当
(5)接种细胞起始浓度太低
细胞已老化
(7)支原体污染
建议解决方法
(1)比较新培养液与原培养液成分,比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。
让细胞逐渐适应新培养液。
(2)换入新鲜配制培养液,或补加谷氨酰胺及生长因子。
(3)用无抗生素培养液培养,如发现污染,丢弃培养物。
或用抗生素除菌。
(4)血清需保存在-5℃到-20℃。
培养液需在2-8℃避光保存。
含血清完全培养液在2-8℃保存,并在2周内用完。
(5)增加接种细胞起始浓度。
换用新的保种细胞。
(7)分离培养物,检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染,丢弃培养物。
问题8:
培养细胞死亡
可能原因
(1)培养箱内无CO2
(2)培养箱内温度波动太大
(3)细胞冻存或复苏过程中损伤
(4)培养液渗透压不正确
(5)培养液种有毒代谢产物堆积
更多原因参考问题4和问题7
建议解决方法
(1)检测培养箱内CO2
(2)检查培养箱内温度
(3)取新的保存细胞种
(4)检测培养液渗透压。
注意:
大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260–350mOsm/kg。
加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
(5)换入新鲜培养液
站细胞培养常见问题
1.液体培养基的保存是冷藏好?
还是冷冻好?
要冷藏!
!
因为液体培养基经冷冻后再经溶化时,其溶液的pH值会发生改变,溶液往往变碱,某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。
故液体培养基一定要存放在冷藏箱中,通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~一年。
2.液体培养基中谷氨酰胺的作用,及使用方法。
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。
所以,各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。
谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置-20◦C冰冻保存,用前加入培养基中。
加有谷氨酰胺的液体培养基4◦C冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。
基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1ml/支)。
每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中,其终浓度为2mM/ml培养基。
包装为粉红色,-24◦C保存。
3.培养用液pH对细胞生长的影响
由于,大多数细胞适宜pH为7.2~7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。
各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受差,无限细胞系耐受力强。
但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。
因此,我们在配制培养用液时,可把液体的pH稍微调得偏酸一些。
液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时,溶液的pH还会向上浮动0.2左右。
4.常用培养基及培养用液的渗透压范围
培养基名称渗透压范围(mOSM)
DMEM(高糖)315~350
DMEM(低糖)270~330
RPMI-1640260~290
MEM-EBSS280~310
MEM-NEAA280~310
McCoy5a280~310
MEM-a280~310
M—199275~305
IMDM270~300
DMEM/F-12280~310
F—10270~300
F—12275~300
培养基名称渗透压范围(mOSM)
L—15280~320
D-Hanks280~300
Hanks280~300
PBS275~300
5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?
不见得!
因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++,Mg++离子和血清等因素有关。
通常情况下,pH8.0,温度37oC其作用能力最强。
另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。
我们每次进行传代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶,以便于将含血清的培养基冲洗干净,这样就能大大提高消化液的消化能力。
本中心通常使用的消化液浓度为:
(1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;
(2)0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA。
(3)0.25%胰蛋白酶
溶液pH8.0~9.0;使用D-Hank液配制。
多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。
6.培养基在使用过程中应注意的问题:
(1).培养基在使用前需37oC预热或在室温平衡后再使用。
(2).细胞培养过程中,吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培养基焦化,将有害物质带入培养液中。
(3).尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。
(4).避免液体间、细胞间的交叉污染。
(5).配制完全培养基时,配制的量最好在2周内用完为好。
7.血清的有关问题:
新生牛血清:
新出生牛5天内取血制成
小牛血清:
小牛出生16周以内采血制成。
胎牛血清:
(进口血清)要求剖腹取胎制成。
国内厂家往往不能做到,经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。
根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:
(1).特级胎牛血清:
40纳米过滤,内毒素含量≤10EU,
血红蛋白含量≤10mg/dl。
(2).优等胎牛血清:
经过3次100纳米过滤,
内毒素含量≤25EU/ml,
血红蛋白含量≤25mg/ml。
(3).标准胎牛血清:
3次100纳米过滤,低内毒素,
低血红蛋白含量。
(4).活性碳/葡聚糖处理血清:
激素含量大大降低。
(5).透析型胎牛血清:
次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。
8.其他细胞培养用液:
除培养基、血清、谷氨酰胺外,其他几种液体也属必须,不可省略。
(1).双抗:
200倍,(1ml/支)其终浓度为青霉素100U/ml;链霉素100ug/ml,-24oC保存。
(2).L-谷氨酰胺:
100倍,(1ml/支),终浓度2mM,-24oC保存。
(3).丙酮酸钠:
配制浓度50mM,4ml/支,终浓度为1mM/ml,
-24oC保存。
(4).Hepes液:
配制浓度1M(5ml/支),一支Hepes加入到200ml
完全培养基中,终浓度为25mM/ml,常温保存。
9.支原体污染及检测:
(1).支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。
支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,最小直径0.2um,可通过滤器。
目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测,形势不容乐观。
污染率达30%~60%。
课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。
支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。
因此,在运用各种细胞
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