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组织培养复习资料
植物组织培养planttissueculture是指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体,甚至幼小的植株,放在无菌条件下,在人工控制的环境条件下,培养在培养基上对
其进行克隆,使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
外植体explant用于培养的植物胚胎、器官、组织、细胞和原生质体通常称为外植体。
无菌asepsis是进行组织培养的基本要求,指培养的器皿,器械,培养基,外植体等处于无真菌,细菌,病毒等有害生物状态,以保证外植体在培养器皿中正常生长和发育。
植株培养plantculture对完整植株材料的离体无菌培养。
胚胎培养(embryoculture)从果实或种子子房中国分离出来成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养的技术。
器官培养organculture以植物的根茎叶花果实等器官为外植体的离体无菌培养技术。
细胞培养cellculture在离体条件下对单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖的技术)对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞,花粉单细胞,或很小的细胞团进行培养,形成单细胞无性系或再生植株的技术。
原生质体培养protoplastculture指将植物细胞的细胞壁通过物理或化学的方法去除,然后再进行培养。
原生质体培养的最大用处是体细胞杂交。
初代培养primaryculture将外植体进行的第一次培养,称为初代培养。
继代培养subculture组织培养中,外植体或培养物培养一段时间后,为了防止培养的细胞老化,或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累二产生的毒害的影响,要技术将其转接到新鲜的培养基中继续进行培养,使其能够顺利地增殖、生长、分化,成长完整的植株。
这一过程称为继代培养。
植物离体培养plantcultureinvitro由于外植体已脱离了母体,因此植物组织培养又称为植物离体培养。
组织培养tissueculture是对植物体的各部分组织,或对植物器官培养产生的愈伤组织进行培养。
固体培养solidculture加入琼脂等凝固剂使培养基呈固体状态的培养
液体培养liquidculture在培养基中部添加任何凝固剂使培养基呈液体状态的培养。
极性polarity植物分化的一个基本现象,指在植物的器官、组织甚至单个细胞中,在不同轴向上存在的某种形态结构和生理生化上的梯度差异。
单倍体育种haploidbreeding利用离体的花粉或花药培养的单倍体育种。
体细胞杂交(somatichybridization)通过原生质体的融合,获得杂种体细胞以创造新的物种的方法。
打破物种间生殖隔离,实现有益基因的种间交流,改良植物品种,创造植物新类型的有效途径。
(将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术)
原生质的融合protoplastfusion通过物理或化学方法进行原生质体融合,经培养获得具有双亲全部或部分遗传物质后代的方法。
转基因育种transgenicbreeding就是用分子生物学的方法把目标基因切割下来,通过克隆、表达载体构建和遗传转化使外来基因整合进植物基因组的育种方法。
种质资源germplasmresource
无病毒苗virus-freeseedling利用未成熟的,幼嫩的组织培养出病毒含量少,或不带病毒的幼苗。
快速繁殖rapidpropagation通过茎尖,茎段等产生大量腋芽,或通过根,叶等器官直接诱导产生不定芽,或通过愈伤组织培养产生不定芽的方法。
植物细胞全能性celltotipotency植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组,并具有发育成为完整植株的潜在能力。
细胞分化differentiation是指导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在发育方式的改变的过程。
脱分化dedifferentiation也称去分化,指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂,逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态,形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。
再分化redifferentiation离体偶尔有的植物细胞和组织可以有脱分化状态重新进行分化,形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官,甚至形成完整植株,这个过程称为再分化。
胚状体embryoid或体细胞胚somaticembryo在植物组织培养中,起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成具有双极性的胚状结构,叫胚状体。
其特点有:
1、不同于合子胚,因为它不是两性细胞融合产生。
2、不同于孤雌/雄胚,因为它不是无融合生殖的产物。
3、不同于器官发生方式形成的茎芽和根,因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构。
原生质体protoplast通过质壁分离,能够和细胞壁分开的那部分细胞物质。
培养基culturemedium是植物组织培养的物质基础,也是组织培养能否成功的重要因素之一。
培养基的主要成分是植物生长发育所必需的各种营养元素、对植物组织培养起调控作用的生长调节物质以及碳源、维生素、有机添加物等。
植物分生组织培养meristemculture指对植物体的分身组织进行离体培养。
茎尖分生组织apicalmeristem是植物顶端的原生分身组织和它衍生的分身组织,具有非常旺盛的细胞分裂能力和很强的生命力。
基因表达geneexpression指存储遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。
位置效应positioneffect一般来说,基因不管占有哪个位置,其遗传效应不变,但少数也有因为基因所处的位置不同而改变其表现的。
化学信号chemicalsignals指植物体内的一些在细胞外或在胞内进行信息传递的物质。
培养基culturemedium是植物组织培养的物质基础,包含植物生长所需的各种营养成分。
驯化现象acclimation继代培养开始阶段,需加入较高浓度的生长调节物质,随着继代培养时间的延长,只加入少量或不加人生长调节物质,试管苗或愈伤组织也可正常增殖的现象。
衰退现象recession长期继代培养材料会发现形态发生能力丧失,生长发育不良,再生能力和增殖率下降等现象。
植物愈伤组织培养callusculture是指在人工培养基上诱导外植体产生一团无序生长的薄壁细胞及对其培养的技术。
平板培养plateculture将一定密度的单细胞悬浮液接种到固体培养基胡总进行培养的技术。
看护培养nurseculture用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单细胞,是单细胞持续分裂和增值,而获得但细胞形成的细胞系的培养方法。
微室培养micro-chamberculture将接种有单细胞的少量培养基,置于微室中培养,使但细胞生长繁殖的培养方法。
细胞悬浮培养cellsuspensionculture将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
分批培养batchculture将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养,目的是建立单细胞培养物。
连续培养continuousculture在培养过程中,以不断抽取悬浮培养物并不断注入新鲜培养基,排出用过的培养基,保持体积恒定。
细胞同步化synchronization同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
子房培养ovaryculture指在无菌条件下对子房进行离体培养的技术。
植物繁殖propagation方式包括有性繁殖sexualpropagation和无性繁殖asexualpropagation,wegetativepropagation两大类。
有性繁殖是指用种子进行繁殖的方式,无性繁殖是指用种子以外的营养器官进行的繁殖方式。
胚乳培养endospermculture在无菌条件下对胚乳组织进行离体培养的技术。
离体授粉invitropollination在离体培养的条件下,对子房或胚珠进行授粉并形成果实或种子的过程。
植物离体授粉invitropollination指在离体培养条件下对子房或者胚珠进行授粉并形成果实或种子的过程
褐化在离体块繁的初代培养和启动生长中,往往会出现外植体接种到培养基后,很快就出现外植体及其接触到的培养基部分变成褐色的部分的现象。
玻璃化vitrification在继代培养和快速增殖中有时会出现一种试管苗变成肿胀,半透明易折断的畸形苗现象。
人工种子artificialseeds利用细胞全能性,将植物离体培养产生的体细胞胚或具有发育成完整植株能力的分身组织包埋在具有营养物质和保护功能外壳内,形成在适宜条件下能够发苗出苗的颗粒体。
植物脱毒virsuelimination是指通过物理或化学的方法将植物体内有害病毒及类似病毒取出而获得无病毒植株的过程。
热处理heattreatment利用病毒病原与植物的耐热性不同,将植物材料在高于正常温度的环境条件下处理一定时间,使植物体内的病原钝化或者失去活性,而植物的生长受到较小影响的方法。
检测detection指利用物理化学或者生物学的方法,确定植物是否带毒以及带何种病毒的技术。
植物种质离体保存invitroconservation是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等种质材料,采用限制。
延缓或停止其生长的处理使之保存,在需要时可重新恢复其生长,并再生植株的方法。
方法有限制生长保存(低温保存、高渗透压保存、生长抑制剂保存、降低氧分压保存、干燥保存法)和超低温保存。
单倍体haploid具有配子染色体组成的细胞或个体。
组培应用前景:
1作物育种上的应用(1花药和花粉培养2胚胎培养3细胞融合4基因工程5培养细胞突变体6种质保存)2作物脱毒和快繁上的应用(马铃薯,兰花)3在植物有用产物生产上的应用4在遗传、生理、生化和病理研究上的应用。
植物组织培养应用步骤:
1获得无菌外植体,建立起无菌培养体系。
2进行增殖,不断产生不定芽或胚状体。
3生根培养。
4试管苗移栽。
植物体胚胎发生的方式:
直接途径(从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚胎,这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已“决定”了的,可以直接诱导出体细胞胚胎)和间接途径(有两种情况:
一是在固体培养中外植体先脱分化形成愈伤组织,再从愈伤组织的某些细胞,即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎;二是悬浮培养中先产生培性细胞团再形成体细胞胚。
多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的)
实验室设计:
准备间缓冲室接种室培养间驯化室温室
实验室布局:
准备室(洗涤室,药品室,称量室,培养基配制室,灭菌室)—接种室—培养室—驯化室—其他部分
高压蒸汽灭菌锅的类型:
大型卧式中型立式小型手提式
超净工作台类型:
垂直式水平式使用方法:
单人单面双人单面双人双面
培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
1固体培养基2液体培养基。
3半固体培养基
高压灭菌锅:
分大型卧式、中型立式、小型手提式等不同类型。
大型效率高,小型方便。
灭菌锅有手动控制,也有自动和半自动控制,由微电脑控制的全自动高压灭菌器使用也越来越普遍。
(排气阀,压力表,电源,带螺丝锅盖)
使用方法:
一、高压灭菌锅使用前要水加到水位线;二、将需灭菌的培养基、蒸馏水或其它器皿放入灭菌锅内,关闭锅盖,检查排气阀、安全阀状态,三、打开电源,检查参数设置是否正确,然后按下“work”键,灭菌锅开始工作;自动派冷气,到105℃时,底部排气阀门自动关闭,然后压力开始上升;四、压力升至0.15MPa(121℃)时,灭菌锅再次自动放气,然后开始记时,一般培养基灭菌20min,蒸馏水灭菌30min;五、达到规定的灭菌时间后,关闭电源,打开放气阀缓慢放气;当压力指针降至0.00MPa时,放气阀无蒸汽排除时,方可开启锅盖。
超净工作台注意事项:
超净工作台是一台较精密的电气设备,对其进行经常性的保养和维护是非常重要的。
首先要保持室内的干燥和清洁,潮湿的空气既会使制造材料锈蚀,还会影响电气电路的正常工作,潮湿空气还利于细菌、霉菌的生长。
清洁的环境还可延长滤板的使用寿命。
另外,定期对设备的清洁是正常使用的重要环节。
清洁应包括使用前后的例行清洁和定期的处理。
熏蒸时,应将所有缝隙完全密封,如操作口设有可移动挡板封盖的类型超净工作台,可用塑料薄膜密封。
超净工作台的滤板和紫外杀菌灯都有标定的使用年限,应按期更换。
使用方法:
(1)每次使用超净工作台时,实验人员应先开启超净工作台上的紫外灯,紫外照射20分钟后使用。
(2)开启超净工作台工作电源,关闭紫外灯,并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。
(3)整个实验过程过程中,实验人员应按照无菌操作规程操作。
(4)实验结束后,用消毒液擦拭工作台面,关闭工作电源,重新开启紫外灯照射15分钟。
(5)如遇机组发生故障,应立即通知实验动物室,由专业人员检修合格后继续使用。
(6)实验人员应注意保持室内整洁。
(7)超净工作台的滤材每2年更换一次,并作好更换记录。
培养基的组成:
无机营养:
植物组织细胞和整体植株一样,生长时需要一定的无机元素,若这些元素或多或少以至完全缺乏,都会影响细胞的生长和分化。
无机物中有13种是植物必须的,即N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl。
I虽然不是植物必需元素,但几乎所有的培养基中都添加I,有些培养基中还加入钴“Co”镍“Ni”等元素,这些元素加入培养基利于植物组织细胞的在离体条件下生长和发育。
氨基酸:
氨基酸是蛋白质的组成成分,也是一种有机氮化合物。
常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物(如水解酪蛋白、水解乳蛋白)等。
有机氮作为培养基中的惟一氮源时,离体组织生长不良,只有在含有无机氮的情况下,氨基酸类物质才有较好的效果。
维生素类:
能明显地促进离体组织的生长。
培养基中的维生素主要是B族维生素,如硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、烟酸(维生素B3,又称维生素PP)、泛酸(维生素B5)、生物素(维生素H)、钴胺素(维生素Bl2)、叶酸(维生素B11)、抗坏血酸(维生素C)等。
有机附加物:
有机附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物,如椰乳(CM)、香蕉泥、番茄汁(TJ)、马铃薯泥、苹果汁、生梨汁、西瓜汁、酵母提取液(YE)、麦芽浸出物(ME)等。
糖类:
糖在植物组织培养中是不可缺少的。
它不但作为离体组织赖以生长的碳源,且还能使培养基维持一定的渗透压(一般培养基渗透压维持在1.5~4.1MPa)。
渗透压对细胞的增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。
一般多用蔗糖调节渗透压,其浓度为1%~5%,也可用砂糖、葡萄糖或果糖等。
琼脂;在固体培养时,琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物。
琼脂以色白、透明、洁净的为佳。
琼脂是一种高分子的碳水化合物,从红藻等海藻中提取,仅溶解于热水,成为溶胶,冷后(40℃以下)即凝固为固体状的凝胶。
琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸、过碱也会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。
植物生长调节物质:
植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用:
培养基中的关键物质:
主要包括生长素和细胞分裂素。
生长素能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。
主要生理作用:
诱导愈伤组织的产生;促进细胞脱分化;促进细胞的伸长;促进生根。
常用的生长素有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4—二氯苯氧乙酸(2,4-D)。
细胞分裂素:
细胞分裂素有天然的和人工合成的。
常用的有TDZ、玉米素(ZT)、苄氨基腺嘌呤(6-BA)、激动素(KT)等。
主要生理作用:
促进细胞分裂和扩大(与生长素促进细胞伸长作用不同),可使茎增粗,而抑制茎伸长;抑制衰老。
活性炭(AC):
活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响,如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
这在兰花组织培养中效果更明显。
活性炭使培养基变黑,有利于某些植物生根。
活性炭对物质吸附无选择性,因此使用时应慎重考虑,不能过量,一般用量为0.1%~0.5%。
活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。
pH(下降0.3到0.5个单位):
培养基的pH因培养材料不同而异,大多数植物都要求在pH5.6~5.8的条件进行组织培养。
在培养过程中,培养基的pH不是一成不变的,往往随着培养基的水分和养料的消耗,pH会发生一些变化。
配制培养基时,常用0.lmol/L的NaOH和0.lmol/L的HCl来调节培养基的pH。
pH的高低会影响琼脂的凝固能力。
培养基种类
据其营养水平分:
基本培养基、完全培养基
据其态相分:
固体培养基、液体培养基
据其作用分:
诱导培养基、增殖培养基、生根培养基
据培养物的培养过程分:
初代培养基、继代培养基
组织培养中常用的培养基主要有:
MS、White、N6、B5、Heller、Nitsch、Miller
常用培养基的特点
1MS培养基这是目前应用最广泛的一种培养基。
特点是无机盐的浓度高,具有高含量的氮、钾,尤其硝酸盐的用量很大,同时还含有一定数量的铵盐,这使得它营养丰富,不需要添加更多的有机附加物,就能满足植物组织对矿质营养的要求,有加速愈伤组织和培养物生长的作用,当培养物久不转移时仍可维持其生存。
2White培养基又称WH培养基是1943年由White设计的,1963年做了改良。
特点:
无机盐浓度较低。
它的使用也很广泛,无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。
3N6培养基特点:
KNO3和(NH4)2SO4含量高,不含钼。
目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。
4B5培养基特点:
含有较低的铵盐,较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。
铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用,但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长
培养基的配制方法
将配制好的母液按顺序排列,先取适量的蒸馏水放入容器,然后依次用专用的移液管按需要量吸取各种母液,并混合在一起。
再将琼脂(事先加热溶解)和糖加入其中,最后加蒸馏水定容至所需体积。
随即用0.lmol/l的NaOH和HCl将pH调至所需的数值,然后分装到培养瓶中。
培养基的pH大多数植物都要求在pH5.6~5.8
培养基的灭菌:
培养基一般采用湿热灭菌法,压力108kPa、温度为121℃时,维持20min,即可达到灭菌的目的。
若灭菌时间过长,会使培养基中的某些成分变性失效。
但时间过短,不能保证灭菌的效果,易引起培养基污染。
培养基储藏在4~10℃的条件下。
固体培养基的特点:
使用简便,一般用于组织、愈伤组织、短枝、茎尖等材料的培养。
特别适合植物的快速繁殖。
缺点:
一块外植体只能部分接触培养基,不能浸没在培养基中,结果培养物上下部因接受养分不匀而形成差异,不易使细胞群体保持一致。
液体培养基特点:
提供比较均匀的营养,而且细胞的增殖速度快,一般用于细胞,原生质体的培养,也可用于愈伤组织的培养,胚状体等材料的继代培养。
灭菌方法:
1物理灭菌(通过物理手段消灭微生物的方法)包括干热灭菌(如烘烤和灼烧)、湿热灭菌、射线灭菌(如紫外线、超声波或微波处理)、过滤灭菌(如空气过滤和液体过滤)等;2化学灭菌时利用各种化学杀菌剂杀灭微生物而实现无菌方法,常用的化学杀菌剂有升汞、福尔马林(40%甲醛)、双氧水(过氧化氢)、高锰酸钾、次氯酸钠、漂白粉、酒精、抗生素等。
灭菌操作则主要是进行环境灭菌、培养基灭菌、外植体灭菌及接种工具灭菌等。
灭菌操作:
环境灭菌培养基灭菌外植体灭菌接种工具灭菌
外植体灭菌的一般步骤
1预处理,先对植物组织进行修整,去掉不需要的部分,将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。
经过预处理的植物材料,其表面仍有很多细菌和真菌。
2将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中,注入75%的酒精溶液埋没材料,浸泡10S左右。
倒出酒精,用无菌水冲洗一次。
3.将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween80),使材料完全浸没在消毒液中,盖上盖,把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。
在灭菌期间须把玻璃瓶摇动2~3次。
4消毒处理后,将瓶盖打开,将消毒液倒出,注入适量的无菌蒸馏水,再盖上盖,摇动数次,将水倒掉,重复3~4次。
各种外植体的灭菌方法
1茎尖、茎段及叶片等的消毒:
植物的茎、叶部分多暴露于空气中,有的具有茸毛、油脂、蜡质和刺等,在栽培上又受到泥、肥中的杂菌污染,所以消毒前要经自来水较长时间的冲洗。
消毒时要用70%的酒精浸泡数秒,无菌水冲洗2~3次,然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度,分别采用2%~10%的次氯酸钠溶液浸泡10~25min,若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80,消毒后用无菌水冲洗3次后方可接种。
2果实及种子的消毒:
根据清洁度,用自来水冲洗10~20分钟,甚至更长时间。
再用纯酒精迅速漂洗一下。
果实用2%次氯酸钠溶液浸10min后,用无菌水冲洗2~3次,就可取出果实内的种子或组织进行培养。
种子则要先用10%次氯酸钠浸泡20~30min甚至几小时。
对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%~2%溴水消毒5min。
进行胚或胚乳培养,对种皮太硬的种子,可先去掉种皮,再用4%~10%的次氯酸钠溶液浸泡8~10min,经无菌水冲洗后,即可取出接种。
3花药的消毒:
用于培养的花药,实际上多未成熟,由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护,通常处于无菌状态,所以只要将整个花蕾或幼穗消毒就可以了。
一般用70%酒精浸泡数秒,然后用无菌水冲洗2~3次,再在漂白粉清液中浸泡10分钟,经无菌水冲洗2~3次即可接种。
4根及地下部器官的消毒:
根和地下部器官生长于土中消毒较为困难。
除预先用自来水洗涤外,还应用软毛刷刷洗,用刀切去损伤及污染严重部位,吸水纸吸干后,再用酒精漂洗。
可采用0.1%~0.2%升汞浸5~10min或2%次氯酸钠溶液浸10~15min,然后以无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干后可接种。
无菌操作
植物组织培养的接种是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞,并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程,是一种无菌技术。
整个操作的过程,一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌。
在操作过程中引起的污染,主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。
1)接种室的消毒:
植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术,做好接种室的消毒是至关重要的。
污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子,因此,每次接种前半小时应进行地面的清洁卫生工作,并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降。
用紫外线灯照射20分钟。
接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗。
2)工作人员要求:
①入无菌室前,要洗手。
②入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。
③操作前要用70%酒精擦洗手,操作中要经常用酒精擦洗手。
不准讲话,以免微生物污染材料、培养基和用具。
每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。
④必须在酒精灯火焰处进行操作,如打开瓶口,转接材料。
盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下,再将盖子也在火焰上烧一下,然后盖上。
3)材料的切取
切取和接种较大的材料肉眼观察即可操作分离,较小的材料需在双筒解剖镜下操作。
分离工具一定要放好,切割动作要快,防止挤压使材料损伤而失败。
接种时要防止交叉污染的发生,通常在无菌滤纸上切取材料。
将用过而已污染的滤纸继续使用,或已用过的工具未及时消毒而再继续使用,极易产生一连串的交叉污染现象。
因此,刀和镊子等接种工具使用一次应
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