DNS法测定还原糖的含量.docx
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DNS法测定还原糖的含量
DNS法测定还原糖的含量
Chemistry
实验原理
3,5■二硝皋水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化介物,在一定范实验围内反应的还原糖的呈和棕红色物质颜色深浅的程度成•定
比例关系,可测定生成化合物的吸光度,由标准曲线反推出述原糖的浓度。
操作简便,快[速,杂质干扰较少,适于生物制氢中还原糖含量的测定。
Chemistry
显色条件包括:
波长选择,显色剂用量,显色时间,溶液酸度,显色温度,有机络合物的稳
定性及共存离子的干扰等此次实验选择波长选择显色剂用量,显色时间,溶液酸度进行实验。
一.试剂的配證
DNS试剂,称貼8.l992g酒石酸钾钠溶丁50m嚥懈水中,加热.趁热加入0.6313g3,5•二硝基水杨酸
(DNS),另配制2mol/lNaOH溶液,取26.2ml加入上述溶液中,称星0.5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠移入配置好的溶液中,蒸18水定容至100ml,该试剂避光保存7〜10天。
葡萄糖标准溶液(1.0*l0-2mol/l):
准确称®0.1990g无水簡萄糖,待溶解后定容至100ml容最和中。
葡萄糖标准溶液(1.0*10-3mol/l>:
取10ml上述10・2mol/l溶液,稀释至100ml容量瓶中。
匍萄辎标准溶液(1.0*10-4mol/l>:
取伽I上述10・3mol/l溶液,稀释至100ml容量瓶中。
二•显色条件的选择
1.波长选择取5支试管按卜-表加和应溶液.沸水浴15min,均加入7m冰定容为10ml,流水冷却,在不同波长处分别进行扫描。
试管号
0
1
2
3
4
DNS/nil
0
2
2
2
1
水/ml
3
1
糖/ml
0
0
1
1 «lO^mol/l) 2 图1为不同条件卜溶液的波长——吸光度图(水涮零八由图1可以看出白色号绿色曲线几乎重命说明0.0001mol/l葡萄糖溶液与DNS反应生成的氮基化合物极州用比色法很难区分.故此法所能够测吊的俪葡糖浓度应人JL0.0001mol/L 由DNS+H2O肘线可以存出当波长大J530nm时.DNS的吸比应已綽很小.这时DNS竹反应牛成的粽圧化合物吸光度的讹响町以忽略° 图2为4号试管稀释10倍后波长扌I描图 逸扌羊540如作为赧住吸收波L mI>**>iv***Iv|*1iiii /;—(X a 5105205X540550560570 Fig.24-}试讼林甘10仃G波匕打描 4号•试管川离浓度的匍羽榊洛液和少尿的DNS试剂反应,伙 生成大眾的氨基化合物•但其吸光度太大•仪器无法测定•故 将其稀邸10倍。 以水调零未出现最髙席.以DNS调零时(图2) /i: 540nm处有最奇峰.这说明在该浓度下.DNS町能会对氨垄 化合物吸光度的测航仃佼大影响,故测啟时以DNS训零较准确 2・DNS用厳选择取试符按卜我加相应溶液,沸水浴 3(加in,加入适最水使定容为10ml,流水冷却,以1号 试管中DNS溶液为参比,在540H1U处测吸光度。 UWH) t 2 3 4 9 5 MVal 4 2 L 15 2 15 > 15 3 1 H-i(r 0 L 2 I I 山图31«r以看出溶液的吸光度随着dns用ntm大而增大,但当DNS用量达到3・5讷时,吸光度反而下降,这说明DNS的用杲不是越多越好,只要在与糖的反应中DNS有剩余即可。 如果DNS用量过多,会使测量时DNS溶液浓度过大,造成测最不准。 综合考虑,此次实验选 3.反应时间(水浴时间)取试管按卜•表加相应溶液,沸水浴相应时间后,加入7nil水定容为10ml,流水冷却. 以6©试管中的DNS试剂凋冬,在540niu处测吸光度。 4 6 1 A ■ i 1 B * V ml 0 2 2 才 <- 2 2 2 2 2 3 1 11MOr Z AW皿 0 2 I I I 1 0 I 1 1 KM/■kn 15 10 IB 30 25 15 30 40 由图4可以看出,随着煮沸时间的加长,吸光度 加大,另有实验表明单纯加热DNS试剂也会使其 吸光度增大,故在制作标准曲线和测定未知浓 度时,煮沸时间必须相同。 此次实验确宦晟佳 煮沸时间为30mino 4反应溶液的酸度范西的选择 取试符按下表加相应试剂,由于所用器皿为试管,不方便用PH计调节PH,此次实验采用加入不同敬的6%的盐酸溶液的办法,以PH试纸调节洛液的酸度。 点沸2011in・各加入7nl水定容为1血1•流水冷却.以MS试剂调零./l;540m处测吸光喪。 0 1 3 4 6 ? 0 2 2 2 2 2 2 2 S- I IB 0 0 1 p 1 I1 1 HI / >H 11 s 9 LO 7 >H 图5中的PH是用PH试纸调出的,该曲线只能反映变化趋势.山图5町以看岀.溶液的碱性越强.反应进彳j•的越完全.溶液的酸度越小.越有利『氨菇化合物的生成。 另外由于DNS试列就定用NaOH溶液配制的•址纯DNS与水的混合液的PH值己经超过14•且DNS在皮应屮是过贾的.反应时间是足够长的,故测量时只需将被测溶液调至中1k无需刻意调节反应混合物溶液的PH值,保证测琏时DNS试剂、糖的用量与制作标准曲线时相同即可。 0.3 025 02 <015 0.1 0.05 a 6810121416PH piciurr5 三.标准曲线的建龙 取试竹按下农加柑应试剂,由0・01耐1/1葡豁丽标准液配制“10•■ol/l(3<二只<二27)的葡萄糖•恿沸30・in后.各加入7讥水定容为101L流水冷却,以DNS试剂调零,在540niu处测吸比度。 • 1 > I ■ 9 • ■ 9 ! • II a M DW 0 V. ■ 1 1 2 1 J ■ 1 2 1 £ 1 2 1 3 1 WtlBM ■ 1 1 l 1 1 B 1 f 1 1 i 1 I IMne » 5 ■ II 1、 IT H x> 21 卜用I为匍簡糖标准曲线图.匍萄糖含S: (BOl/l) 与相应的吸光度(A)有一定的线性关系,且其回归方程为: y=・0」4971+0.035786X.R=0.9954c 1020304050007080, Siucc^standardarvdglUClBWChn>llkl/IOm<>UI 010463.0W16MMFU000617 OD •••••••• gluccnc*MarxlMilcurveI 另外采用较高浓度的葩萄糖來制作标准曲线,得到下图2: 其回归方用为: y=-0.10483+0.031804x,R=0<99817. 当所测得的吸光度比较小时,可用图1中的方程 ,当所测得的吸光度较大时,可用图2中的方程 下一步实验计划: 1・重复以上已做实验,找到几组较准确的实验数据,做出匍萄糖标准曲线。 2•探索秸秆屮葡萄糖含量与产氢量的关系,将本次实验结果服务J: 生物制氢。 谢谢!
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- DNS 测定 还原 含量