禽流感病毒中和实验doc.docx
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禽流感病毒中和实验doc
禽流感病毒中和实验及其他方法
(一)实验材料
1、中和反应实验材料
(1)病毒:
一般为鸡胚尿囊病毒液,进行中和实验前,需要进行病毒滴度(TCID50)的滴定。
(2)血清样品
包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。
人血清实验前需要56℃30分钟灭活,动物血清需RDE处理。
-20℃储存,避免多次反复冻融。
(3)MDCK细胞和细胞培养试剂
1)MDCK细胞(狗肾上皮细胞)
2)MDCK细胞培养液:
DMEM+5%牛血清+抗生素,过滤除菌
500毫升DMEM(修饰的Eagles培养基)
5.5毫升100×抗生素(100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素)
5.5毫升100×L-Glutamine(2毫摩尔)
25.5毫升56℃、30分钟加热灭活的牛血清
3)胰酶/EDTA
(4)其它
1)平底96孔微量培养板
2)病毒稀释液:
DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素,即配即用。
429毫升DMEM
66毫升7.5%牛血清白蛋白(BSA)
5毫升100×抗生素
3)TPCK-胰酶(使用浓度为2微克/毫升)
4)固定液:
80%的丙酮,即配即用,4℃保存
400毫升丙酮
100毫升PBS,PH7.2
2、ELISA实验材料
(1)抗体1:
鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体
(2)抗体2:
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG
(3)洗涤液:
PBS+0.05%TWEEN-20
4升PBS,PH7.2
2毫升TWEEN-20
(4)封闭液:
PBS+1%牛血清白蛋白+0.05%TWEEN-20
867毫升PBS,PH7.2
132毫升牛血清白蛋白
1毫升TWEEN-20
(5)底物和底物溶液:
常用的辣根过氧化物酶(HRP)所用底物为磷苯二胺(OPD)
底物溶液为PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.05M)
底物和底物溶液:
10毫克OPD
20毫升柠檬酸缓冲液(含0.015%双氧水)
即配即用
磷酸盐-柠檬酸缓冲液,PH5.0
58.8克柠檬酸三钠
1升蒸馏水
用盐酸调节PH为5.0
加0.015%双氧水,(临用前加入)
*如果使用磷酸盐-柠檬酸缓冲液胶囊(Sigma)1个胶囊加入100毫升蒸馏水,临用前配制
(6)终止反应液:
1N硫酸(28毫升浓硫酸+1升蒸馏水)
3、其他
细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器(参照英文讲义)
备注:
A.以上实验材料购自Gibco,,Hyclone,Dynatech,Kirkegaard&Perry和Sigma公司,材料编号(CAT#)参照英文讲义。
B.实验材料的配制,例如0.25%的胰酶等,请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。
(二)质量控制
病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程,参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。
这些因素的变化都会影响中和实验的结果。
因此,对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。
每次测定必须设立阳性和阴性血清对照,阳性和阴性细胞对照,以及对病毒使用剂量进行滴定。
1、血清对照
血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。
即血清中含有(阳性对照)或不含有(阴性对照)对测定病毒特异性的中和抗体。
血清对照一般分装成多份,-20℃保存,并避免反复冻融使用。
(1)阴性血清对照
1)动物血清一般来自未免疫或未感染动物,即与待检血清同种动物的正常血清。
2)人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群,该人群未曾暴露于待检病毒。
3)测定过程中,阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。
(2)阳性血清对照
1)动物血清一般来自免疫后或感染后动物。
2)人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。
*人血清使用前须经加热灭活处理,动物血清则须经霍乱滤液RDE(即受体破坏酶)处理,以排除非特异性反应因素。
2、病毒和细胞对照
每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照,以及对加入病毒工作液进行滴定检查,以便获得准确可靠的实验结果。
(1)阳性和阴性细胞对照
一般设立4个重复孔为阳性细胞对照,即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量(100TCID50)的病毒进行混合培养。
同时设立4个孔为阴性细胞对照,即将细胞与病毒稀释液进行混合培养。
阳性细胞对照:
50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。
阴性细胞对照:
100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞
(2)病毒工作液滴度检查
一般第1孔加入含有200TCID50的100微升病毒液,然后进行2倍稀释,再与MDCK细胞进行混合培养。
病毒滴度检查:
50微升2倍系列稀释病毒液(第1孔为100TCID50)
+50微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞(1.5×104细胞/孔)
(三)实验步骤
1、病毒滴度测定(组织培养半数感染量-TCID50滴定)
(1)流感病毒制备
利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒,收获尿囊液,血凝实验测定病毒的存在,分装后-70℃冻存。
(2)病毒的稀释
1)取1管冻存病毒尿囊液,1:
100稀释(100微升病毒液+9.9毫升稀释液)
2)第1排孔加入146微升1:
100稀释过的病毒液,然后做系列半对数稀释,使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。
每孔含100微升病毒液,每个稀释度重复4孔,详细操作参见图1。
*人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞,因此病毒稀释液中需加入2微克/毫升的TPCK-胰酶。
某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下即可感染MDCK细胞,因此在测定新病毒滴度时,最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液,以获得最佳结果。
(3)MDCK细胞的准备
1)使用前2天将MDCK细胞1:
100传代,使之70~90%成片,处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性,细胞过度生长以及代数太高(大于30代)将使细胞对病毒的敏感性降低。
2)弃去细胞培养液,用5毫升胰酶/EDTA洗细胞一次,然后弃去。
3)加4到5毫升胰酶/EDTA覆盖细胞(162cm2的细胞培养瓶)37℃5%CO2温箱中消化10~20分钟。
4)待细胞开始脱落时,加5~10毫升MDCK细胞培养液,吹打分散细胞,并将细胞转入离心管中,用PBS洗2次,以去除牛血清。
5)将细胞悬浮于病毒稀释液中,用1毫升吸管充分吹打分散细胞,在细胞计数板上计数细胞数量。
6)用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升。
7)加100微升细胞(1.5×104细胞/孔)于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。
8)在37℃5%CO2温箱中培养18-22小时。
(4)测定组织细胞半数感染剂量(TCID50)
1)弃去微量培养板中的细胞液,250微升PBS洗细胞一次。
2)弃去PBS(不要让细胞干燥),加入100微升/孔固定液。
3)覆盖微量培养板,于室温固定细胞10分钟。
4)弃去固定液,让微量培养板室温干燥。
5)用ELISA检测细胞感染(参见ELISA部分)
6)利用ELISA检测仪,于490纳米波长,测定每孔吸光度(OD)值,计数细胞阴性对照孔的平均OD值。
7)若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上,则判断为病毒生长阳性。
8)根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算,最终获得TCID50/100微升(参见附录和表2)。
9)在进行中和实验前,稀释病毒液,使之50微升中含有100TCID50流感病毒。
2、病毒微量中和实验
(1)待检血清的准备和稀释
1)检测对一种病毒的中和抗体需要10微升血清,每份血清需要进行至少1次重复测定(共需至少20微升血清/每种病毒),每块板可检测11份样品。
2)人血清需56℃加热灭活30分钟。
3)实验设计请参照图2。
4)每孔中加入50微升病毒稀释液。
5)第1排中(A1-A11)再加入40微升病毒稀释液,使之成为90微升/孔。
6)加入10微升待检血清于第1排A1-A11。
7)将待检血清作系列倍比稀释(A-H)使之成为1:
10、1:
20、1:
40……1:
1280。
(2)病毒的准备
1)稀释病毒至100TCID50/50微升。
根据病毒特性选择是否在病毒稀释液中加入TPCK胰酶(大约5毫升/每板)。
2)除细胞阴性对照孔(4孔)外,每孔加入50微升病毒工作液。
3)加50微升病毒稀释液于细胞阴性对照孔。
4)选择1列孔做病毒工作液滴度核实。
第1孔加入200TCID50/100微升病毒工作液,做系列倍比稀释,使之成100TCID50,50,25,12,6……0.7。
然后每孔加入50微升病毒稀释液,使体积至100微升/孔。
5)摇匀病毒-血清混合物,放37℃温箱作用2小时。
(3)MDCK细胞的准备。
(参见病毒滴定测定部分)
加100微升细胞液(1.5×104细胞/孔)于含有病毒-血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中,37℃温箱孵育18-22小时。
*当测定大量样品时,每叠培养板一般不超过4-5块,各叠板之间要保持一定距离,以确保混合物受热均匀,从而达到良好的中和效果。
(4)细胞的固定
1)弃去微量培养板中的细胞液。
2)250微升PBS洗细胞一次。
3)弃去PBS(不要让细胞干燥),加入100微升/孔固定液。
4)覆盖微量培养板,于室温固定细胞10分钟。
5)弃去固定液,让微量培养板室温干燥。
3、酶联免疫吸附实验(ELISA)
ELISA的基本原理是:
酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合,再遇酶底物时,在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应,即形成有色的产物,便可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。
该方法具有特异性、敏感性、快速性和简易性等优点。
在流感病毒微量中和实验中,酶结合物(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体)与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合,HRP酶催化OPD,使无色底物形成橙黄色化合物,再由ELISA检测仪测定吸光度值,从而获得中和抗体滴度。
(1)实验操作
1)用250微升PBS洗涤微量培养板3次,以去除残余的丙酮。
2)用封闭液1:
4000(或最佳稀释度)稀释抗体1(抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体)
3)每孔加入稀释后的100微升抗体1,室温作用1小时。
4)用250微升洗涤液洗板4次以除去抗体1。
5)用封闭液1:
2000(或最佳稀释度)稀释抗体2(HRP标记的羊抗鼠IgG)。
6)每孔加入稀释后的100微升抗体2,室温作用1小时。
7)用250微升洗涤液洗涤板6次以除区抗体2。
8)每孔加OPD底物100微升(10毫升OPD+20毫升柠檬酸缓冲液+10微升30%双氧水,即用即配)。
9)室温放10分钟左右显色,直至细胞阳性对照孔变橙黄色,而细胞阴性对照孔尚未变色时,每孔加1M硫酸100微升终止反应。
10)在ELISA测定仪上(490纳米)读出每孔OD值。
(2)结果判定
下列公式用于判定中和反应结果
(细胞阳性对照平均OD值—细胞阴性对照平均OD值)/2+细胞阴性对照平均OD值=X
X=细胞半数感染阈值,每孔OD值低于X值时,判定为中和反应阳性,中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的和抗体滴度。
*在特殊情况下可用目测法判定结果,即加底物后,肉眼下出现橙黄色反应的为阴性。
无色为阳性。
待检系列稀释血清中无色孔的最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。
*流感病毒中和实验的质量控制
a.阴性血清对照孔的OD值应该与阳性细胞对照孔的OD值无明显差别。
b.病毒工作液滴度检测孔,上数3-5孔呈阳性反应,显示正常病毒量。
孔序
1
2
3
4
5
6
7
8
TCID50
100
50
25
12
6
3
1.5
0.7
OD值
+
+
+
+
+
-
-
-
若超过5孔阳性,则为病毒过量,若少于3孔阳性,则为病毒量不足。
c.阴性细胞对照孔的OD值一般小于0.2,阳性细胞对照孔的OD值一般在1左右。
d.每次测定中,阳性血清对照的中和抗体滴度应该在2倍之内波动。
4、操作注意事项
(1)待检人血清需56℃30分钟灭活,动物血清需RDE处理。
(2)待检血清需要重复测定时,应分装后冻存,以免反复冻融。
(3)每管病毒只使用一次,若重复使用,或血清阳性对照结果过高或过低,以及细胞阳性对照OD值过低,须对病毒进行重新滴定。
(4)MDCK细胞应处于对数生长期,严禁细胞过度生长或老化(代数过高)。
因此,必须在10代前进行细胞冻存,保存于液氮中备用。
(5)牛血清有中和病毒感染力的作用。
试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。
(6)病毒与抗血清混合,常规采用37℃作用1小时,该实验采用37℃作用2小时,但针对不同耐热性的病毒,孵育温度和时间应有所增减。
(7)在ELISA过程中,每步都要洗涤,以保证结果可靠。
(8)选择合适的抗体稀释浓度,一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗体进行ELISA测定,以获得最佳稀释度。
(9)正确控制显色时间,以降低背景染色。
(10)大量测定时,为稳定培养液的PH值,可用HEPES增加溶液的缓冲能力,减少PH变化对细胞的不利影响。
(11)在缺少病毒特异性抗体的情况下,可用细胞病变观察或测量培养板中每孔血凝活性来替代ELISA方法,但细胞培养时间须从18-22小时增至2-4天。
4、病毒TCID50滴度的计算
组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度,一般使用Reed-Muench方法计算。
(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目
(1)和阴性孔数目
(2)
(2)计算阳性和阴性孔的累积数。
阳性孔累积数由下向上累计(3);阴性孔累积数由上向下累计(4)
(3)计算阳性孔的百分比:
比率(5)=(3)/〔(3)+(4)〕,(6)=(5)×100
(4)计算距离比例
距离比例=(大于50%的阳性百分比-50)/(大于50%的阳性百分比-小于50%的阳性百分比)=(75-50)/(75-0)=0.3
TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例×稀释系数的对数=5+0.3×0.5=5.15
TCID50=10-5.15/100微升
100TCID50/50微升=10-2.8
100TCID50/50微升=1:
631稀释
(5)稀释系数的对数
1:
10稀释为1,半对数稀释为0.5,倍比稀释为0.3,1:
5稀释为0.7。
五、流感实验室检测中应注意的若干问题
1、禁止在同一实验室,更不应在同一接种柜中,同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。
2、禁止在同一实验室,同一时间处理,接种采自不同动物的标本;动物标本(如禽、猪等)必须与人的标本分别保存。
3、接种后剩余原始标本,尤其分离出病毒的标本需暂时冻存,有条件的应置-70℃或以下保存,以便需要时可进行复查,待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。
分离阴性的标本应随时弃之。
4、严禁实验室交叉污染:
在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。
5、向国家流感中心送毒株时,量至少需5ml,同时需自己保存一些,以便寄送过程发生意外时可继续补送。
6、流感病毒在-20℃~-40℃时不稳定,故不宜在此温度下长期保存。
7、鸡胚中分离出的流感病毒,应尽量别在MDCK细胞上传代。
因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系,一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。
8、寄送毒株时一定需附上送检表。
寄送毒株需及时,尤其鉴定不出的,异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。
寄送时用快速直送国家流感中心。
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