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病理切片笔记
病理检验技术讲稿
一、组织切片常用仪器与制片技术
1、切片机及使用
切片机提供石蜡切片(或炭蜡切片)用,是切片中最常用的一种。
超薄切片机的构造与使用原理基本也属于这一类型。
(图4-1-1)
摇动轮的手柄转动重轮时,传动机内一组齿轮及螺纹中轴,使中轴前端的组织块固定架即按所调节的切片厚度(μm)向前推进,并上下运动,让组织块经过前下方
的轮时,传动机内一组齿轮及螺纹中,使中轴前端的组织块固定架即按所在切片操作
轴前先打开卡锁,否则重轮不能转动。
然后,将组
织块固定于固定架,最后再装切片刀。
组织块及
切片刀先后装牢固后才可掀开卡锁。
慢慢转动重
轮使装有组织块的中轴稍下降到接近刀刃处,调
整刀的前、后进度,使刀刃即将接触组织块。
调
整刀的进度时,不让刀刃接触组织块,以免第一
次切到时崩落组织块。
此时将组织进度调节器,调
节到20μm,开始切片,待组织块切到所需的组织图4-1-1旋转式切片机
断面时,再调节到所需的切片厚度,如5μm或其
它厚度。
在装组织块前,可将组织蜡块予以修整;如切成方形的断面使组织周围的空白勿超过1-3mm宽,组织前面的蜡也尽量切去到能清晰看到组织本身,这样在切片机上切片时可节省不少的切片时间。
在切片机上切片时,如发现因切片刀有缺口而致组织块出现划痕时,应稍向左、右移动切片刀避开切口,再正式切片。
旋转式切片机一般不宜切大块组织(不超过1.8cm),切片时转动重轮的速度也要均匀适宜,太快或太慢均不易切成石蜡连续切片带。
结构优良的切片机可在组织块另行处理后能切成1μm厚的“半薄切片”。
切片工作结束后应先卡紧卡锁,再卸下切片刀,最后卸下组织块,做其他处理。
任何切片技术工作者都应养成先卡紧卡锁再在机上操作的良好习惯。
这样就完全可以避免切片刀伤人或砸坏组织块及切片刀的事故发生。
2、脱水机:
(图4-1-2)
脱水机是对动物标本按程序浸于各种溶剂进脱水、透明、侵蜡的精密仪器,根据需要,可分别使用不同功能的脱水机。
生物组织自动脱水机的脱
水筐体积较大,能同时对120~150块组织进行
脱水并且运转可靠,控温、定时准确,脱水效果
好,使用维修方便,特别是采用单缸揭盖技术,
减少了空气污染等功能。
有的机器还有交直流电
源两用,市电停电后,由后备直流电源给整机供
电,完成脱水全过程;有的机器还设有延时加热
的功能,在组织入蜡缸前4小时自动开始加温,
即节约了能源,又延长了机器寿命。
还有的机器
还编入了多套程序,可供不同组织、不同的制片图4-1-2数显组织自动脱水机
目的选择使用。
3、切片制作技术
1)、取材
组织取材的方法是制作切片的一个重要程序,必须根据教学和科研的具体要求取自人体(外科手术切除标本、活检标本、尸检标本)或动物,并确定取材的部位和方法,否则对组织结构就看不全面。
取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识,还要掌握实际操作技术,每个组织器官的取材都有一定的部位和方法,不能任意切取组织作为制片材料,不然,无法达到教学和科研的目的,具体要求如下:
(1)、材料新鲜:
取材组织愈新鲜愈好(人体组织一般在离体2小时以内取材),动物组织则应在处死后立即取材,并迅速固定,以保证原有的形态学结构。
(2)、组织块的大小:
所取组织块较理想的体积为1.8X1.0X0.2cm,以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部,但根据制片材料和目的不同,组织块的较理想体积也不同,如制作病理外检、科研切片,其组织块可以薄取0.1~0.2cm即可,这样可以缩短固定脱水透明的时间,若制作教学切片报厚取0.3~0.5cm,这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。
(3)、勿挤压组织块:
切取组织块用的刀剪要锋利,切割时不可来回挫动。
夹取组织时切勿过紧,以免因挤压而使组织、细胞变形。
(4)、规范取材部位:
要准确地按解剖部位取材,如胰腺,一般取胰岛较多的胰腺尾部;脊髓取腰膨大与颈膨大处,病理标本取材按照各病变部位、性质的不同,根据要求规范化取材。
(5)、选好组织块的切面:
根据各器官的组织结构,决定其切面的走向。
纵或横切往往是显示组织形态结构的关键,如长管状器官以横切为好。
(6)、保持材料的清洁:
组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等,可用生理盐水冲洗干净后入固定液。
(7)、保持组织的原有形态:
新鲜组织固定后,或多或少产生收缩现象,有时甚至完全变形。
为此可将组织展平,以尽可能维持原形。
神经、肌肉组织等可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。
(8)、动物品种的选择:
如观察肥大细胞,以取材于大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜组织直接作铺片为好;内耳、胰岛细胞的观察,多取材于豚鼠的内耳和胰腺;运动终板的观察多取才于小鼠的胁间肌。
2)、固定
(1)、小块组织固定法:
从人体或动物体取下的小块组织,须立即置入液态固定剂中进行固定,标本:
固定液为1:
4~20,这是最常用的方法,但组织块不易过大过厚,否则固定液不能迅速渗透。
故取组织块的大小一般为1.8X1.0X0.3cm为宜。
组织块厚度不易超过0.5cm,如需厚度超过0.5cm,最好置入冰箱冷藏室内固定,冷藏固定时间适当延长,特别是组织化学实验用的材料,冷藏固定效果会更好。
(2)、注射、灌注固定法:
某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部,或需要整个脏器或整个动物体进行固定。
这时宜采用注射固定或灌注固定法。
将固定液注入血管,经血管分枝达整个组织和全身,从而得到充分的固定。
(3)、蒸汽固定法:
比较小而厚的标本,可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。
多用于涂片、印片及压片标本的固定。
如血液涂片,则应在血片末干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。
操作时,应先将有盖玻璃容器内加入适量1-2%锇酸水溶液或10%甲醛溶液,将涂片标本放入高出固定液面1cm以上的固定架上,待盖好容器盖后加温55℃左右,1~5分钟即可。
常用的固定液有两大类即单纯固定液和混合固定液,其种类繁多,最常用的单纯固定液有10%甲醛固定和95`%乙醇固定液。
最常用的混合固定液有:
·酒精-甲醛固定液(95%酒精9份、40%的甲醛1份);
·Zenken氏液(重铬酸钾2.5克,升汞5.0克,蒸馏水100ml,冰醋酸5ml);
·Bouin氏液(苦味酸饱和水溶液25ml,40%甲醛25ml,冰醋酸5ml)等。
3、脱水透明
标本经过固定和冲洗后,组织中含有较多的水分,必须将组织块内的水分置换出来,这一过程叫做脱水。
无论是用石蜡切片,还是用火棉胶切片,都必须除去组织中所含水分,因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容,常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。
脱水的步骤是:
80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时,此过程可用脱水机自控完成。
丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂,但因其脱水能力很强,对组织有剧烈收缩作用,在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。
但因其沸点低,脱水力强,加温至沸点时在短时间内可脱水彻底,故病理外检快速石蜡切片时可用丙酮脱水剂。
因乙醇、丙酮等不溶于石蜡,还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。
常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、冬青油等。
4)、浸蜡、包埋
(1)、浸蜡熔点:
石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种,熔点为42~54℃一般称为软蜡,熔点为56~62℃称为硬蜡。
浸蜡时,应先经软蜡再经硬蜡,(常用的浸蜡熔点为52~54℃、54~56℃、56~58℃Ⅲ级浸蜡),使组织中含有的透明剂完全去尽。
(2)、浸蜡温度:
浸蜡的温度应高于熔点的2~5℃为宜,温度过高可致组织过度收缩或变脆,如在温箱内浸蜡,要将温度控制在60~65℃的范围。
(3)、浸蜡的时间:
可根据组织块的大小及其组织种类而定。
一般厚度约0.2cm的实质性器官(肝、肾、脾等)的浸蜡时间约为2~3小时,内窥镜镊取小标本的浸蜡时间约1小时,组织块多时需增加浸蜡时间。
(4)、包埋:
将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中,石蜡凝固后,组织即被包在其中,称
蜡块,此过程称为包埋。
包埋用的石蜡和加温的镊子均不能温度过高,防止组织被烫伤,破坏组织结构。
包埋用的蜡温度应与组织块本身的温度相等,如温度不一,可造成组织与周围石蜡脱裂的现
象。
包埋所用的石蜡要求无杂质,
并有一定的粘韧性。
蜡的熔点与组织块相适应,
过硬的组织(如骨组织、肌肉组织、皮肤等)可
用,必要时加以过滤以免异物或残渣污染组织或损
害切片刀。
组织包埋时亦可用包埋机操作。
5)、切片和贴片
用硬度较高的石蜡包埋。
包埋用的石蜡可以重复使
(1)、修整蜡块:
可视其组织的大小,在组织边缘
约0.1-0.2cm处,切去余蜡部分,否则易造成组织皱缩不平。
图4-1-3组织包埋机
(2)、准备好切片用具:
磨好并经过镜检的切片刀、毛
笔、眼科镊子(弯)、单面刀、加温的水盆或切片漂烘温控仪、夏天须准备好冰块。
(3)、安装蜡块:
将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上,如蜡块较多并较大可直接安装在切片机的组织块夹持器中进行切片,但夹持器螺旋不能旋的过紧,否则蜡块被压裂。
(4)、安装切片刀:
将切片刀安装在切片机的刀台上,把刀台上的紧固螺丝旋紧,使切片时不产生振动,能保持一定的切片厚度。
(5)、切片刀与蜡块的角度:
切片刀与蜡块应有一定的角度,系指刀锋的下面和水平面所形成的角称倾角又称清扫角。
此角若过大则切片上卷,过小则切片皱起。
若用平凹面刀,则平的一面必须向着蜡块,凹面向外,将预定使用的刀口部位移至蜡块的下方,调节蜡块夹持器的方向螺旋,使蜡块平切面与刀峰准确平行。
刀的倾角一般以4°~10°为宜,双平面刀侧角以12°~15°为宜,如切较硬的组织倾角以30°左右为宜。
(6)、切片的厚度:
切片机的厚度调节器上刻有0~50μm或0~25μm,可任意选择其厚度,石蜡切片的厚度一般在4~6μm。
(7)、切片:
用右手握住切片机旋转轮的手柄,左手握住微调推进器的手柄,调整组织块前后的进度,待组织块即将接触刀刃时,再用左手缓慢移动微调推进器的手柄,右手上下移动旋转轮的手柄进行“粗切”,待组织“切全”后,松开左手,以右手转动旋转轮,石蜡便被切成一条蜡带,即谓石蜡连续切片,这时左手持毛笔牵引着蜡带向前拉,到一定长度便可用毛笔轻巧取下。
(8)、铺片:
用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40~45℃的水面上,借水的张力和水的温度,将略皱的蜡带自然展平。
(9)、贴片、烘片:
待切片在恒温水面上充分展平后,用镊子将每一张蜡片分离,将洁净的栽玻片垂直插入水中,轻轻将其捞到栽玻片的中段处倾去栽玻片上的余水用钻石笔在载玻片的一侧写上标本的编号后放在烤片架上,置入60~65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15~30分钟,脱去溶化组织间隙的石蜡即可染色。
6)、染色和封片
常用的染色方法是苏木素-伊红(HematoxylinEosin)染色法,简称H.E染色法.这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。
苏木素是一种碱性染料,可使组织中的酸性物质(又称嗜硷性物质)染成兰色,如细胞核中的染色质等;伊红是一种酸性染料,可使组织中的碱性物质(又称嗜酸性物质)染成红色,如多数细胞的胞质、核仁等在H.E染色的切片中均呈红色,很容易与胞核区别,染色剂多为水溶液,故染色前必须先经二甲苯脱蜡,再用乙醇由高浓度到低浓度脱苯、复水,最后用流水洗去乙醇,即可染色。
先用苏木素染细胞核,用自来水洗去切片上的染液,再用1%盐酸乙醇分色,分色的目的是去除细胞核以外不应着色部分的颜色,使细胞核着色清晰适度。
颜色分辨鲜明。
分色时间凭经验控制。
分色后用流水充分洗涤去除余酸。
最后用0.5%的伊红液染细胞质。
染色后的切片,因组织内含水而不透明,需再次用乙醇脱水、二甲苯透明。
为了达到长期保存的目的,在切片标本上滴加树胶,再加一盖玻片,此过程为封固。
H.E染色程序如下:
(1)、脱蜡、脱苯、复水:
二甲苯Ⅰ1分钟
二甲苯Ⅱ1分钟
无水酒精Ⅰ30秒
无水酒精Ⅱ30秒
95%乙醇Ⅰ30秒
95%乙醇Ⅱ30秒
85%乙醇30秒
75%乙醇30秒
自来水洗2-3次
(2)、染色:
苏木素染液5-10分钟
自来水洗2-3次
1%盐酸酒精(80%酒精)分化15-60秒
自来水洗2-3次
碳酸锂饱和水溶液15-30秒
自来水洗2-3次
(3)、脱水、透明、封固:
80%乙醇15-30秒
95%乙醇Ⅰ15-30秒
95%乙醇Ⅱ15-30秒
无水乙醇Ⅰ15-30秒
无水乙醇Ⅱ15-30秒
二甲苯Ⅰ15-30秒
二甲苯Ⅱ15-30秒
中性树胶加盖片将切片标本封固。
苏木素染液的配制方法甚多,各有其不同的作用及特点,以下介绍两种常用的配制方法。
·哈瑞(Harris)氏苏木素液
苏木素1克
纯酒精10毫升
钾明矾(硫酸铝钾)20克
蒸镏水200毫升
氧化汞0.5克
先将苏木素溶于纯酒精中,另将钾明矾加温溶于蒸镏水中,待钾明矾全部溶解,再将苏木素酒精溶液加在一起,混合后煮沸,避开火源缓缓加入氧化汞,用玻璃棒搅拌,此时液体变为深紫色,再煮沸速将烧杯放于流动冷水之中,使液体立即冷却,隔日过滤。
使用时再加冰醋酸4毫升,可增加其染色力。
也可将染液使用一段时间后再加入冰醋酸,这样可延长苏木素染液的使用寿命。
·Gill氏苏木素液
蒸馏水146.00毫升
乙二醇50.00毫升
苏木素0.40克
碘酸钠0.04克
硫酸3.52克
冰醋酸4.00毫升
混合后搅拌半小时,即可应用。
此方法配制方便,使用效果同Harris氏苏木素液。
苏木素用量小,不需加温或煮沸,故称之为Gill氏苏木素液冷配法.
附:
伊红(曙红Eosin)染液的配制法:
常规苏木素染色中的对比染色是用伊红,近年来在英、美国家的一些实验室则采用焰红(phloxine),此外也有用桔黄G(OrangeG)、比布里希猩红(Biebrichscarlet)、波尔多红(Bordeauxred)等作为对比染色。
伊红为染胞浆、胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒等常用的染料。
它是一种钠或溴盐的酸性染料。
伊红染液的配制比较简单:
水溶液为0.5~1%
醇溶液为0.5~1%(80%乙醇)
二、组织化学技术与细胞化学技术
1、糖类显示法
显示多糖和蛋白多糖常用的方法是过碘酸-雪夫反应(periodicacidSchiffreaction,PAS反应)。
●试剂:
1%过碘酸水溶液;Schiff氏液;亚硫酸溶液;苏木精或甲绿复染液。
●材料:
肝脏组织冰冻切片。
●实验步骤:
1)、肝脏切片入95%酒精10分钟。
2)、蒸馏水稍洗。
3)、1%过碘酸水溶液浸洗10~15分钟。
4)、蒸馏水洗数次。
5)、入Schiff氏液作用30分钟。
6)、亚硫酸溶液洗2~3次,每次约1分钟。
7)、自来水充分冲洗(约5分钟),蒸馏水稍洗。
8)、苏木精复染1~3分钟或甲绿复染液复染15分钟。
9)、自来水冲洗、晾干。
10)、中性树胶封片
对照:
可先用唾液淀粉酶滴于切片上,置37℃作用30分钟~1小时,再按实验步骤进行。
●结果:
PAS反应阳性部位可见红色颗粒。
对照片应为PAS反应阴性,证明阳性反应物为糖原。
●原理:
含乙二醇基的糖类,经过碘酸氧化产生双醛基,双醛基与Schiff氏液反应,使无色品红变为紫红色沉淀物显现于含多糖部位。
附:
Schiff氏液配制方法1g碱性品红溶于200ml沸水,当冷却至60℃时,过滤。
过滤后加1NHCl20ml,亚硫酸氢钠2g,塞紧瓶口过夜。
次日再加入1g活性炭,摇匀,过滤,滤液应为无色透明,塞紧瓶口,置暗、冷处备用。
染液变红则失效。
亚硫酸溶液配制方法:
10%亚硫酸氢钠(或偏重亚硫酸钠)5ml,1NHCl5ml,蒸馏水90ml。
2、核酸显示法
●甲绿-派洛宁法甲绿-派洛宁(Methylgreen-Pyronin)染色法是显示核酸常用的方法。
1)、试剂:
Carnoy固定液;甲绿-派洛宁染液
2)、材料:
新鲜小鼠骨髓涂片或血涂片
3)、实验步骤:
(1)、骨髓涂片或血涂片在Carnoy固定液中固定10~15分钟。
(2)、80%酒精浸洗2~3分钟。
(3)、蒸馏水洗数次。
(4)、入甲绿-派洛宁染液30分钟。
(5)、蒸馏水速洗,除去片上浮色,空气中晾干。
(6)、中性树胶封片或直接油镜观察。
对照:
涂片固定后,先用核糖核酸(RNA)酶37℃消化1小时再进行实验步骤,此对照片上只显示脱氧核糖核酸(DNA)。
4)、结果:
RNA呈红色,见于核仁和胞质中;DNA呈蓝绿色,见于细胞核的染色质。
5)、原理:
甲绿和派洛宁均为碱性染料,它们可以分别与细胞内的DNA和RNA结合而呈现不同的颜色。
甲绿易与聚合程度较高的DNA结合而使之呈绿色,派洛宁能与聚合程度较低的RNA结合使之呈红色。
附:
甲绿-派洛宁染液的配制方法2%甲绿液配制:
原装甲绿一般都混有甲基紫,故配制甲绿-派洛宁染液前,必须先将甲基紫除去。
方法是:
取原装甲绿3~5g,溶于100ml蒸馏水中,入分液漏斗中,然后加适量的氯仿(甲绿液∶氯仿=1∶1.5),充分摇匀,然后静置,待氯仿呈紫色时,弃去氯仿部分,保留水溶液部分,如此抽提甲基紫数次,直至氯仿无紫色为止。
将甲绿液保存于冰箱备用。
5%派洛宁液配制:
5g派洛宁加入100ml蒸馏水中,置40℃温箱中加温溶解,可以搅拌,待完全溶解后过滤备用。
甲绿-派洛宁染液配制:
2%甲绿水溶液6ml,5%派洛宁水溶液2ml,0.1mol的醋酸盐缓冲液16ml,蒸馏水16ml,使用前临时混合。
存于冰箱,可用数次。
●Feulgen反应Feulgen反应是用来显示DNA的一种染色法。
1)、试剂:
Carnoy固定液;Schiff氏液(配制同前);亚硫酸溶液;1NHCl;0.5~1%亮绿。
2)、材料:
新鲜小鼠骨髓涂片
3)、实验步骤:
(1)、骨髓涂片在Carnoy固定液中固定10~15分钟。
(2)、80%酒精浸洗2~3分钟。
(3)、蒸馏水洗数次。
(4)、1NHCl(室温)浸洗3分钟。
(5)、1NHCl(60℃)水解8~10分钟。
(6)、稍冷却入1NHCl(室温)浸洗2分钟。
(7)、蒸馏水洗数次。
(8)、入Schiff氏液作用30分钟~1小时,37℃温箱中,应密盖染色缸,否则易失败。
(9)、亚硫酸溶液洗3次,每次约1.5分钟。
(10)、自来水洗5~10分钟。
(11)、0.5%亮绿复染1~3分钟
(12)、水洗、晾干、封片或不封片直接油镜观察。
对照:
不经HCl水解,其它步骤相同,则呈阴性反应。
或先用DNA酶水解,再按实验步骤进行,也呈阴性反应。
4)、结果:
DNA呈紫红色,胞质呈绿色。
5)、原理:
DNA经HCl水解产生醛基,醛基与Schiff氏试剂结合形成一种紫红色沉淀物,因此染色后,胞核中有紫红色产物处,即DNA所在之处。
3、脂类物质显示法
脂类物质包括脂肪和类脂,染色方法很多,在此,仅介绍两种方法。
●油红O中性脂肪染色法油红O(oilred)染色法是显示脂类物质常用的方法。
1)、试剂:
油红O染液;Harri氏或Ehrlich氏苏木精。
2)、材料:
肾上腺冰冻切片。
3)、实验步骤:
(1)、冰冻切片用蛋白甘油贴于载玻片上。
(2)、切片经60%异丙醇淋洗30秒~1分钟。
(3)、浸入油红O稀释染液5~10分钟。
(4)、60%异丙醇分色至背景无色。
(5)、蒸馏水速洗。
(6)、Harri氏或Ehrlich氏苏木精复染3~5分钟。
(7)、1%Na2HPO41~2分钟使胞核变蓝。
(8)、蒸馏水洗。
(9)、甘油明胶封片。
4)、结果:
脂滴橘红色,磷脂粉红色,胞核蓝色。
附:
油红O染液配制方法原液:
油红O0.6g,异丙醇(99%)100ml。
稀释液:
油红O原液20ml,蒸馏水20ml,过滤后使用。
●类脂苏丹黑B染色法苏丹染料也是脂类物质染色常用的试剂,苏丹黑B(SudanblackB)染色效果最佳,尤以染磷脂较好。
对粒细胞颗粒和细胞内微细结构染色好。
1)、试剂:
苏丹黑B染色液;Wright氏染液或1%番红花红水液。
2)、材料:
大鼠肾上腺冰冻切片。
3)、实验步骤:
(1)、切片以10%甲醛固定10~30分钟。
(2)、蒸馏水洗1~2分钟。
(3)、入苏丹黑B染色液中染色30分钟~1小时。
(4)、蒸馏水略洗,晾干。
(5)、入Wright氏染液5~8分钟或1%番红花红水液5~10分钟。
(6)、蒸馏水速洗,滤纸吸干。
(7)、70%酒精分色1~3分钟。
(8)、95%酒精和无水酒精分色与脱水各30秒~1分钟。
(9)、晾干后甘油明胶封片。
4)、结果:
类脂呈黑色或蓝黑色,胞核紫蓝色(Wright氏染色)或红色(1%番红花红染色)。
5)、原理:
苏丹黑B为脂溶性染料,染色后与组织中的脂类物质结合,故组织中含脂类物质处呈黑色。
附:
苏丹黑B染色液配制方法苏丹黑B保存液:
苏丹黑B0.15g溶于50ml无水酒精,摇匀,放置2天,时常摇动,使苏丹黑B完全溶解。
碳酸磷酸缓冲液:
石碳酸结晶8g,无水酒精15ml,混合溶解;磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)0.15g,蒸馏水50ml,混合溶解;此二液混合即成缓冲液。
苏丹黑B染色液:
苏丹黑B保存液40ml,碳酸磷酸缓冲液20ml,混合过滤即可使用。
3、酶组织化学方法
酶是一大类特殊的蛋白质,在生物化学反应中起催化剂的作用。
利用这种特性,使酶促反应的终产物形成有色沉淀物,从而检测酶在组织中的定位、活性和定量变化的组织化学方法即酶组织化学方法。
●显示碱性磷酸酶的钙钴法在人体内碱性磷酸酶(Alkalinephosphtase,AlP)主要分布在中性粒细胞、近曲小管和部分血管内皮细胞。
1)、孵育液:
3%β-甘油磷酸钠5ml
2%巴比妥钠5ml
蒸馏水10ml
2%CaCl210ml
2%MgSO41ml
----------------------------------------------------
31ml
上液用1NNaOH将pH调至9.3~9.4。
2)、材料:
肾脏冰冻切片
3)、实验步骤:
(1)、肾冰冻切片用冷丙酮或95%酒精固定15分钟。
(2)、蒸馏水洗数次,约1~2分钟。
(3)、入预温的37℃孵育液中孵育4~6小时。
(4)、自来水洗数次。
(5)、2%硝酸钴中浸3~5分钟。
(6)、蒸馏水洗数次。
(7)、1%的硫化铵中2分钟。
(8)、自来水冲洗。
(9)、2%甲绿复染10~15分钟,流水冲洗。
(10)、晾干,封片。
对照:
孵育液中去掉β-甘油磷酸钠。
4)、结果:
阳性部位呈棕黑色或黑色,细胞核呈绿色。
5)、原理:
β-甘油磷酸钠在碱性磷酸酶的作用下水解(pH9.3~9.4)产生磷酸根,磷酸根与孵育液中的钙离子结合成磷酸钙,与硝酸钴反应产生磷酸钴,磷酸钴与硫化铵反应形成棕黑色硫化钴沉淀。
●显示酸性磷酸酶的铅法酸性磷酸酶(Acidphosphatase,AcP)主要分布于巨噬细胞等一些具有吞噬分解能力的细胞。
1)、孵育液:
蒸馏水74ml
0.5mol醋酸缓冲液(pH4.7)12ml
5%Pb(NO3)22ml
3.2%β-甘油磷酸钠4ml
-------------------------------------------------
92ml
上液用前现配并用1NHCl将pH调至4.7。
2)、材料:
血涂片或组织冰冻切片
3)、实验步骤:
(1)、血涂片或
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