生物化学与分子生物学实验技术扫描模板.docx

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生物化学与分子生物学实验技术扫描模板

一血糖定量测定（GOD-PAP法）

原理

动物血液中的糖主要是葡萄糖,正常情况下,其含量较恒定。

健康家兔的血糖水平为80~120mg／dL。

（dL代表100mL。

）

GOD-PAP法,即氧化酶-过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定普遍采用的方法。

该法测定血糖依据的酶反应为:

醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收,所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。

在同样条件下,测定葡萄糖标准液和样品的光吸收值,即可求出样品中葡萄糖的含量。

试剂和材料

（1）血糖试剂盒:

北京中生生物工程高技术公司产品,含有:

葡萄糖氧化酶（GOD）>13U／mL;过氧化物酶（POD）>0.9U／mL;磷酸缓冲液:

磷酸盐11mmol／L,酚100mmol／LpH7.0;4一氨基安替比林0.77mmol／L;葡萄糖标准液:

100mL／dL。

使用时,将90mL磷酸缓冲液与10mL酶制剂混匀制成的溶液为工作液。

每一试剂盒装有2瓶磷酸缓冲液和2瓶酶制剂。

（2）样品:

（兔血清）

操作

取3支试管,按下表加入试剂。

分别将各试管内容物摇匀,37℃保温10~15min（避免阳光直射）。

用光程为1.0crn的比色杯,在A480~A550波长进行比色。

将测得的A标准、A样品数据代入下述公式,计算出样品中葡萄糖的浓度。

式中C:

样品中葡萄糖的浓度;A标准为葡萄糖标准液在A480~A550波长的光吸收值;A样品:

待测样品在A480~A550波长的光吸收值;C标准为葡萄糖标准液中葡萄糖的浓度。

注意事项

（1）试剂中含迭氮铵做为稳定剂,勿与皮肤、黏膜接触。

（2）制备样品时,血清应在收集血样后1h内与细胞分离。

加糖原酵解抑制剂（NaF,KF）后,15~25℃可贮存24h,4℃在密闭的容器中可贮存7d。

二蒽酮比色定糖法

原理

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。

蒽酮能够和游离的己糖或多糖中的己糖基,戊醛糖及己糖醛酸反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。

蒽酮可与其它一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。

当样品中存在含较多色氨酸的蛋白质时,反应不稳定,呈现红色。

对于以上特定的糖类,反应较稳定。

本法多用于测定糖原含量,亦可用于测定葡萄糖含量。

试剂

（1）蒽酮试剂:

取0.2g蒽酮溶于100mL80％（V／V）硫酸中,当日配制使用;

（2）标准葡萄糖溶液（0.1mg／mL）:

100mg葡萄糖用蒸馏水定容至1L（可滴加几滴甲苯作防腐剂）;（3）标准糖原溶液（0.1mg／mL）:

100mg糖原用蒸馏水定容至1L（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。

操作

（1）制作标准曲线:

取干试管6支,依次加入标准糖溶液0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,并依次用蒸馏水补足体积到1mL,置冰浴中5min,各管均加入蒽酮试剂4mL,沸水浴准确煮沸10min,自来水冷却,室温放置10min,比色测定A620。

（2）样品含糖量测定:

吸取1mL无蛋白糖溶液置试管中,浸于冰浴中冷却,再加入4mL蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10min,取出后自来水冷却后比色,其它条件与做标准曲线相同,测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。

计算

式中A:

为样品稀释后的体积;C:

为标准曲线查出的糖含量（mg／mL）;W:

为样品的重量（mg）。

三血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）

原理

血清经无水乙醇处理,蛋白质被沉淀,胆固醇则溶在无水乙醇中。

在乙醇提取液中加磷硫铁试剂,胆固醇和试剂生成紫红色化合物,呈色度与胆固醇含量成正比,可用比色法测定。

试剂

（1）10％三氯化铁溶液:

10gFeCl3·6H2O（A.R）溶于磷酸（A.R）,定容至100mL。

贮于棕色瓶中,冷藏,可用一年;

（2）磷硫铁试剂（P-S-Fe试剂）:

取10％FeCl3液1.5mL于100mL棕色容量瓶内,加浓硫酸（A.R）至刻度;（3）胆固醇标准贮液:

准确称取胆固醇（C.P）80mg,溶于无水乙醇,定容至100mL;（4）胆固醇标准溶液:

将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得。

此标准液含0.08mg／mL胆固醇。

操作

（1）吸取血清0.1mL置干燥离心管内,先加无水乙醇0.4mL,摇匀后再加无水乙醇2.0mL,摇匀,10min后离心（3000r／min,5min）,上清液备用。

（2）取干燥试管3支,编号,分别加入无水乙醇1.0mL（空白管）、胆固醇标准溶液1.0mL（标准管）、上述乙醇提取液1.0mL（样品管）,各管皆加入磷硫铁试剂1.0mL,摇匀,10min后,分别转移至0.5cm光径的比色杯内,测A505。

计算

四紫外吸收法测定蛋白质含量

原理

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,在280nm处有吸收峰。

且吸收值与其含量呈正比关系,可用作定量测定。

该测定法简单、灵敏、快速、不消耗样品,低浓度的盐类不干扰测定。

因此,在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用,特别是在柱层析分离中,利用280nnl进行紫外检测,是最常见的方法。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差,这是由于:

①酪氨酸和色氨酸含量与标准蛋白质差异较大的蛋白质,有一定的误差;②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质,会出现较大干扰。

核酸对260nm紫外光的吸收比280nm更强。

而蛋白质的A280大于A260,经过计算能够适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。

可是,因为不同比例的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定结果还存在着一定的误差。

在测定工作中,可利用在280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。

对于稀蛋白质溶液还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。

从吸收差△与蛋白质含量的标准曲线即可求浓度。

式中A215:

蛋白质溶液在215nm下测得的光吸收值;A225:

蛋白质溶液在225nm下测得的光吸收值。

此法在蛋白质含量为每毫升20~100μg的范围内是服从比尔定律的。

氯化钠,硫酸铵以及0.1mol／L磷酸,硼酸和Tris等缓冲液都无显著干扰作用。

可是,0.1mol／L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲剂在215nm下的吸收较大,必须降至0.005mol／L才无显著影响。

由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而有所变化,故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH,最好与标准曲线制定时的pH一致。

试剂

标准蛋白质溶液:

准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质,配制成浓度为1mg／mL的溶液。

操作

1．标准曲线的制定

取8支试管,分别加0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mL标准蛋白质溶液（1mg／mL）,用水补足到4mL,混匀。

选用光程为1cm的石英比色池,在280nm处测定各管溶液的光吸收值。

以蛋白质浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘出标准曲线作为定量的依据。

2．样品测定

取适当浓度的待测蛋白质溶液,按上述方法测定280nm处的吸光度值,即可从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

假若已知某一蛋白质在280nm的消光系数[A1%1cm],取该蛋白质溶液于280

nm处测定光吸收值后,便可直接求出蛋白质的浓度。

五紫外吸收法测定核酸含量

原理

DNA和RNA的吸收高峰在260nm处。

嘌呤和嘧啶、核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性,核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用k（P）260nm来表示,k（P）260nm为每升溶液中含有1mol核酸磷的光吸收值。

RNA的k（P）260nm（pH7）为7700~7800。

RNA的含磷量约为9.5％,因此每毫升溶液含1μgRNA的光吸收值相当于0.022~0.024。

小牛胸腺DNA钠盐的k（P）260nm（pH7）为6600,含磷量为9.2％,因此每毫升溶液含1μgDNA钠盐的光吸收值为0.020。

蛋白质由于含有芳香氨基酸,吸收高峰在280nm处,在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。

RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上;DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。

当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。

试剂

（1）钼酸铵一过氯酸沉淀剂（0.25％钼酸铵-2.5％过氯酸溶液）:

取3.6mL70％过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中;

（2）样品RNA或DNA干粉。

操作

将样品配制成每毫升含5~50μg核酸的溶液,于紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸收值,计算核酸浓度和两者吸收比值。

式中A260:

260nm波长处吸光度读数;L:

比色池的厚度,一般为1或0.5cm;0.024:

每毫升溶液内含1μgRNA的吸光度;0.020:

每毫升溶液内含1μgDNA钠盐时的吸光度值。

如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸,则在测定时需加钼酸铵-过氯酸沉淀剂,沉淀除去大分子核酸,测定上清液260nm处吸收值作为对照。

具体操作如下:

取两支小离心管,甲管加入0.5mL样品和0.5mL蒸馏水;乙管加入0.5mL样品和0.5mL钼酸铵一过氯酸沉淀剂,摇匀,在冰浴中放置30分钟,以3000／min离心10min,从甲、乙两管中分别吸取0.4mL上清液到两个50mL容量瓶内,定容到刻度。

于紫外分光光度计上测定A260。

式中△A260:

甲管稀释液A260减去乙管稀释液A260的差。

六二苯胺显色法测定DNA含量

原理

DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应,在595nm处有最大光吸收。

DNA在40~400μg范围内,光吸收与DNA的浓度成正比。

在反应液中加入少量乙醛,能够提高反应灵敏度。

除DNA外,脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。

其它多数糖类,包括核糖在内,一般无此反应。

试剂

（1）DNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）:

取小牛胸腺DNA钠盐以0.01mol／L氢氧化钠溶液配成200μg／mL的溶液;

（2）样品待测液:

准确称取DNA

干燥制品以0.01mol／L氢氧化钠溶液配成100μg／mL左右的溶液。

在测定RNA制品中的DNA含量时,要求RNA制品的每毫升待测液中至少含有20μgDNA,才能进行测定;（3）二苯胺试剂:

使用前称取1g重结晶二苯胺,溶于100mL分析纯的冰乙酸中,再加入10mL过氯酸（60％以上）,混匀待用。

临用前加入1mL1.6％乙醛溶液。

所配得试剂应为无色。

操作

1．DNA标准曲线的制定

取10支试管,分成2组,依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mLDNA标准溶液。

添加蒸馏水,使体积均为2mL。

另取2支试管,各加2mL蒸馏水作为对照。

然后各加入4mL二苯胺试剂,混匀。

于60℃恒温水浴中保温1h,冷却后测定A595。

按DNA的不同浓度分别取两组的平均值,以DNA浓度为横坐标,A595为纵坐标,绘制标准曲线。

2．样品的测定

取2支试管,各加2mL待测液（内含DNA应在标准曲线的可测范围之内）和4mL二苯胺试剂摇匀。

其余操作同标准曲线的制作。

3．DNA含量的计算

根据测得的吸光度值,从标准曲线上查出DNA的含量,按下式计算出制品

中DNA的百分含量:

七地衣酚显色法测定RNA含量

原理

RNA与浓盐酸共热时发生降解