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实验纤维素酶活力的测定
实验纤维素酶活力的测定(3,5-二硝基水杨酸法)
一、实验目的
掌握还原糖的测定原理,学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。
二、实验原理
纤维素酶水解纤维素,产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖,能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。
三、主要仪器与试剂
(一)实验仪器
1.25mL比色管2.722型分光光度计3.滴管4.水浴锅5.移液枪6.电炉
(二)、试剂
1.3,5-二硝基水杨酸显色液:
称取10.0g3,5-二硝基水杨酸,溶入200mL蒸馏水中,加入20g分析纯氢氧化钠,200g酒石酸钾钠,加水至500mL,升温溶解后,加入重蒸苯酚2.0g,无水亚硫酸钠0.50g。
加热搅拌,待全溶后冷却,定容至1000mL。
存于棕色瓶中,放置一周后使用。
2.0.1mol/LpH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3.0.5%羧甲基纤维素钠水溶液,溶解后成胶状液,静置过夜。
使用前摇匀。
4.葡萄糖标准溶液:
称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg,溶解后定容至100mL,此溶液含葡萄糖1.00mg/mL。
5.纤维素酶液:
将0.05g酶溶解定容至50mL,从中取出1.0mL再定容至100mL,待检测用。
(用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制)
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制:
分别吸取0.0,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00mL葡萄糖标准液于6支25mL比色管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水21mL,摇匀。
以空白管调零,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标,以葡萄糖μg数为横坐标,绘出标准曲线。
序号
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标液
0.0
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
蒸馏水
1.0
0.80
0.60
0.40
0.20
0.0
3,5-二硝基水杨酸
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
实验操作
沸水浴加热10min,冷却后,加水定容,摇匀,比色测定
吸光度A550nm
0.0
2.空白管的测定:
在2支25mL试管中各加入1.0mL酶液,沸水浴5min,冷却后加3.0mL0.5%CMC-Na,与样品管同时放入50℃水浴30min。
其它操作同样品管。
3.样品的测定:
在3支25mL试管中各加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液3.0mL,酶液1.0mL,于50℃水浴中糖化30min,取出,立即于沸水浴中煮沸10min使酶失活,得糖化液,冷却加入3.0mL3,5-二硝基水杨酸显色液,再沸水浴10min,冷却后加水定容至25mL,混匀,以空白管调零,在550nm处测OD值,查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg数。
五、结果计算
在上述条件下,1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。
纤维素酶活力单位(μg/mg·min)=
式中:
N—酶液的稀释倍数,此处为100
30—糖化所用时间,min
1—反应酶液的mL数
六、注意事项
1.无论是标准液还是样品液,都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。
使得到的标准曲线经过坐标原点。
2.用移液管或移液枪加各试剂时,不能将移液管或移液枪头混用。
各比色管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水21mL,摇匀。
DeterminationofCellulaseActivity
1.PurposeofExperiment
Mastertheprincipleofdeterminationofreducingsugar,Learnthemethodofdeterminatingcellulaseactivityusing3,5-dinitrosalicylicacidmethod.
2.ExperimentalPrinciple
Cellulasecanhydrolyzecellulosetoproducereducingsugarsuchascellobioseandglucose.Thosesugarscanreducenitroof3,5-dinitrosalicylicacidintoaminotoformorangeyellowaminocompounds,socolorimetricmethodcanbeusedtodeterminethereductionproductexpressedascellulaseactivity.
3.TheMainInstrumentsandReagent
3.1ExperimentalInstrument
(1)25mLcolorimetrictubetype
(2).722spectrophotometer
(3)dropper(4)bath(5)pipette(6)electricfurnace
3.2Reagent
(1)3,5-dinitrosalicylicacidsolution:
Weigh10g3,5-twonitrosalicylicacid,dissolvedin200mLofdistilledwater,adding20gsodiumhydroxideofanalyticallypure,200gsodiumpotassiumtartrate,addwaterto500mL,heatingtodissolvethosereagents.Addingredistilledphenol2.0g,sodiumsulfiteanhydrous0.50g.Heatingandstirring.Whenthereagentsarefullydissolved,cooling.Dilutewithwaterto1000mL.Storedinabrownbottle,layasideaweekbeforeuse.
(2)0.1mol/LpH4.5aceticacid-sodiumacetatebuffersolution.
(3)0.5%CMC-Naliquid:
Weigh0.50gsodiumcarboxymethylcellulose,dissolvedinwatertomakeacolloidalsolution,standingforanight.Shakewellbeforeusing.
(4)1.0mg/mLglucosestandardsolution:
weigh100mganhydrousglucosedriedtoconstantweight,dissolveinwaterto100mL.
(5)Cellulaseliquid:
0.05genzymedissolvein50mLpH4.5aceticacid-sodiumacetatebuffersolution,thensuck1.0mLtoa100mLvolumetricflask,dilutewiththebuffersolutiontoscale.
4.ExperimentalSteps
4.1StandardCurveDrawing:
Adding0.0,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00mLglucosestandardsolutionin6colorimetrictubeof25mL,respectively.Ineverycolorimetrictube,addingdistilledwateruntil1.0mL,thenadding3.5-dinitrosalicylicacidsolution3.0mL,boiledinboilingwaterbath10minforcolordeveloping,thencooling,add21mLofdistilledwater,shaking.Setemptytubezero,determineODvalueat550nm.Usingtheopticaldensityasordinate,glucoseμgnumberasabscissa,todrawthestandardcurve.
SerialNumber
1
2
3
4
5
6
glucosestandardsolution(mL)
0.0
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Distilledwater(mL)
1.0
0.80
0.60
0.40
0.20
0.0
3,5-dinitrosalicylicacid(mL)
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
ExperimentOperation
Heating10mininboilingwaterbath,dilutewithwatertoscaleaftercooling,shake,colorimetricdetermination
AbsorbanceA550nm
0.0
4.2DeterminationofBlank:
Adding1.0mLenzymeliquidineachofthe2tubesof25mL.putinboilingwaterbath5min,aftercoolingadd3.0mL0.5%CMC-Naliquid,thenputin50℃waterbathfor30min.Thesubsequentoperationissameassample.
4.3.DeterminationofSample:
Ineachof325mLtubesadding0.5%CMC-Naliquid3.0mL,cellulaseliquid1.0mL,putat50℃waterbathexactly30minforglycosylation.Thenremoveimmediatelytoputinboilingwaterbathfor10mintoinactivatetheenzyme.Afterthesaccharificationliquidcooling,add3.0mL3,5-dinitrosalicylicacidsolution,thenputagaininboilingwaterbath10mintodevelopcolor,thencooling,dilutewithwaterto25mL,mixing.Setemptytubezero,determineODvalueat550nm.Checkonglucosestandardcurvetogetglucoseμgnumberofsamples
5.ResultsCalculation
Undertheaboveconditions,1mgofcellulasecatalyzeshydrolysisofcellulosetoform1microgramglucosewithin1minuteisdefinedasaunitofactivity.
ActivityofCellulaseUnits(μg/mg·min)=
N—enzymeliquid,hereis100
30—mashingtimeused,min
1—mLnumberofenzymeliquid
6.Notice
(1)whetherstandardorsamplesolution,theotheringredientsexceptglucoseshouldberemovedtoelimilatetheinfluenceeffectly.Thestandardcurveobtainedshouldgothroughtheoriginofcoordinates.
(2)Whenusingpipettestoaddreagents,don’tmixpipetteswithpipettetips.
实验食品中黄酮含量的测定-可见分光光度法
一、实验目的
掌握可见分光光度法测定食品中总黄酮含量的方法。
二、实验原理
黄酮类化合物中的酚羟基能与 Al3+的碱性溶液中生成红色络合物,其颜色深浅与黄酮含量成正比,在510nm波长处有最大吸收,故可比色测定。
三、适用范围
适用于食品中总黄酮含量的测定。
四、仪器及试剂
1.仪器:
可见分光光度计,分析天平,10mL比色管,容量瓶、移液管等。
2.试剂:
10%亚硝酸钠溶液,10%硝酸铝溶液,1mol/L氢氧化钠溶液,乙醇,芦丁标准品等。
五、实验方法
1.标准溶液的制备
精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁标准品100mg,置100mL容量瓶中,加甲醇70mL,置水浴上微热使溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀。
精密吸取10mL,置100mL容量瓶中,加水至度,摇匀,即得0.1mg/mL芦丁。
2.标准曲线的制备
准确吸取芦丁标准溶液(0.1mg/mL)0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL,分别置于10mL比色管中,各加30%乙醇使成5.0mL,各准确加入10%亚硝酸钠溶液0.3mL,充分摇匀,放置6min。
再准确加入10%硝酸铝溶液0.3mL,充分摇匀,放置6min。
各加1mol/L氢氧化钠溶液4.0mL,用蒸馏水稀释至刻度,充分摇匀,放置15min,用分光光度计,在510nm波长处测定吸光度。
以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
3.试样测定
称取一定量的试样置三角瓶中,精确加入70%乙醇50mL,称定重量,超声提取30min,再称定重量,加70%乙醇补足减失重量,摇匀,过滤,取滤液备用。
准确吸取滤液(浓度约0.1mg/mL)2mL~4mL,置10mL比色管中,按标准曲线制备项下自“各加30%乙醇使成5.0mL。
“起依法操作直至测定出样品的吸光度。
六、结果计算
X=
式中:
X)样品中总黄酮的含量(以芦丁计),mg/100g(mL);
A)吸取滤液中黄酮的量,μg;
m)样品的质量,g(mL);
F)样品的稀释倍数。
七、说明及注意事项
1.可见分光光度法测定黄酮含量,应注意控制反应时间、显色时间以及试剂用量等条件。
实验双波长法测定混合颜色液中的单色素
一、实验目的
掌握双波长法测定混合颜色液中的单色素及分光光度计的操作使用。
二、实验原理
双波长测定法是在同一时间内用两个不同波长的光束交替照射同一样品液。
其中一个波长为测定波长,另一个为参比波长。
并由检测器测出两波长下样品液的吸光度差值ΔA,ΔA与被测物质的浓度成正比。
若被测物中含有某种干扰物,但干扰物的最大吸收峰波长与被测物的最大吸收波长之间相差30nm以上,则可用作图法求出适当的λ测—λ参比波长对,以消除干扰组分的影响。
三、仪器与试剂
1.仪器:
分光光度计(带自动扫描功能)500mL容量瓶2个
10mL或50mL容量瓶12个5mL刻度移液管4支
2.试剂:
胭脂红贮备液:
500mg/kg日落黄贮备液:
500mg/kg
柠檬黄储备液:
500mg/kg准确称取50mg各色素,用水溶解并稀释至100mL。
四、波长对选择操作
1.在6个50mL容量瓶中分别加入0.20,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00mL胭脂红贮备液,在另6个容量瓶中分别加入0.20,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00mL日落黄贮备液,分别用蒸馏水稀释至刻度。
2.将上述两种标准系列溶液在分光光度计上扫描,作A~λ光谱扫描曲线,在图上按照作图法原理,在胭脂红标准色素溶液最大吸收波长处作横轴的垂线与日落黄的光谱曲线交于一点,再过这一点作横轴的平行线与日落黄的光谱曲线相交于另一点,得到胭脂红的测定波长λ测1与参比波长λ参比1。
然后在日落黄色素最大吸收波长处作横轴的垂线与胭脂红色素的光谱曲线交于一点,再过这一点作横轴的平行线与胭脂红的光谱曲线相交于另一点,得到日落黄的测定波长λ测2与参比波长λ参比2。
多选择几对波长,按公式A1/A2=K1LC/K2LC=K1/K2=K,计算每组K值,标准偏差与变异系数,选出变异系数小于3%的测定—参比波长对。
五、标准曲线的绘制
在选择的波长对下,以水为参比调零,把上述标准溶液重新测量一次,分别记下这两组标准色素溶液ΔA值,分别作ΔA~CS曲线图。
六、样品测定
准确吸取混和颜色样液2.0mL入50mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
按所选定的测定波长和参比波长,在分光光度计上测得相应色素的ΔA,然后分别从两种物质的标准曲线上找出相对应的浓度。
按下式计算结果:
XX色素(mg/kg)=CX×V定/m×V取
式中:
CX——标准曲线上查得的色素浓度,mg/kg;
V定——样液定容体积,mL;
V取——吸取样液体积,mL;
m——样品的质量,g。
DeterminationofSinglePigmentinMixedColorLiquidbyDual-WavelengthSpectrophotometry
1.PurposeoftheExperiment
Tograspthedualwavelengthmethodfordeterminationofsinglepigmentfrommixedcoloraswellasmastertheoperatingtechniqueofspectrophotometer.
2.ExperimentalPrinciple
Dual-wavelengthmethodistheonewhichusestwolightbeamsofdifferentwavelengthstoirradiatealternatelythesamesamplesolutionatthesametime.Onewavelengthactsasthedetectionwavelength,anotherasthereferencewavelength.AndthesampleabsorbancedifferenceΔAoftwowavelengthsismeasuredbydetector.ΔAvalueisproportionaltotheconcentrationofmeasuredmaterial.Ifthemeasuredmaterialcontainssomechemicalsbutthedifferencebetweenthemaximumabsorptionwavelengthofinterferentandtheonebeingmeasuredisabove30nm,itisavailableformappingmethodtocalculateappropriate-wavelengthpairstoeliminatetheinterferenceofcomponentseffectively.
3.InstrumentsandReagents
(1)Instruments:
spectrophotometer(withautomaticscanningfunction)
500mLvolumetricflask250mLvolumetricflask125mLpipette4
(2)Reagents:
carminestocksolution:
500mg/kgsunsetyellowstocksolution:
500mg/kg;Lemonyellowliquidreserves:
500mg/kg.Weighaccurately50mgpigment,dissolvedinwateranddilutedto100mL.
4.WavelengthSelectionOperation
(1)Inthe650mLvolumetricflaskwereadded0.20,0.50,1.0,2.0,3.0,4.00mLcarminestocksolution,ontheother6volumetricflaskwereadded0.20,0.50,1.0,2.0,3.0,4.00mLsunsetyellowstocksolution,thendilutedwithdistilledwatertoscale.
(2)Scanningthetwostandardseriesofsolutioninthespectrophotometer,makingA~λspectralscanningcurve.Oncarminespectralscanningcurve,inaccordancewiththeprincipleofdrawingmethod,drawalineperpendiculartohorizontalaxisatcarminepigmentmaximumabsorptionwavelengthintersectwithsunsetyellowspectralscanningcurveatonepoint,thenfromthispointdrawahorizontalaxisparallellinesintersectwithsunsetyellowspectralcurvesatanotherpoint,s
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- 实验 纤维素酶活力的测定 纤维素酶 活力 测定