植物生理指标最新实验原理与方法.docx
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植物生理指标最新实验原理与方法
1、氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD)
2、POD(过氧化物酶)活性的测定——愈创木酚法
3、CAT(过氧化氢酶)测定
4、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定
5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:
6、O2-产生速率的测定
7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法
8、丙二醛(MDA)含量的测定
9、还原型抗坏血酸(ASA)和脱氢抗坏血酸(DHA)的测定
10、谷胱甘肽还原酶测定
11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定
12、可溶性总糖的测定
13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量
14、叶绿素含量的测定
15、石蜡制片的制作
16、激素Indole-3-AceticAcid(IAA)、AbscisicAcid(ABA)、GA3和ZA的测定
17、cDNA扩增片段长度多态性技术(cDNA-AFLP)
18、3′/5′RACE扩增基因全长
19、根系活力的测定(TTC法)
一氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD)
【实验原理】
SOD是含金属辅基的酶。
高等植物含有两种类型的SOD:
Mn-SOD和Cu.Zn-SOD,它们都催化下列反应:
由于超氧自由基(O2.-)为不稳定自由基,寿命极短,测定SOD活性一般为间接方法。
并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.-,当加入NBT后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲月替(黄色),继而还原生成二甲月替,它是一种蓝色物质,在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时,可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2,从而抑制了NBT光还原的进行,使蓝色二甲
月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液,光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值,抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。
反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低。
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1.分光光度计
2.台式离心机
(二)材料
1.磷酸氢二钠
2.磷酸二氢钠
3.甲硫氨酸
4.EDTA-Na2
5.核黄素
6.氮蓝四唑(NBT)
7.陶瓷小研钵
8.4-5ml离心管
9.10ml玻璃试管
(三)试剂
1.0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):
A母液:
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:
取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;
B母液:
0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:
取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/LPBS(pH7.8)的配制:
分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml,B母液(NaH2PO4)21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。
2.14.5mM甲硫氨酸溶液:
称取1.0818gMet用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。
3.3mMEDTA-Na2溶液:
称取0.1117gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
4.60μM核黄素溶液:
称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。
5.2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液:
称取0.092gNBT用PBS定容至50ml,避光保存。
【实验步骤】
1.酶液提取
称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清夜即为SOD粗提液。
2.酶活性测定
(1)反应混合液配制(以60个样为准):
分别取配好的Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液6ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀;
(2)分别取3ml反应混合液和40μl(可视情况调整)酶液于指形管中此即反应管;同时做两支对照管,其中1支试管加3ml反应混合液和40μlPBS(不加酶液)作为最大光还原管,另1支加3ml反应混合液和40μlPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。
(3)将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25℃下反应20min;
(4)反应结束后以不照光的对照管调零,分别测定各管在560nm下的吸光度(OD560)
3.计算结果
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位(U),按下式计算活性
n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2
SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)
SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/gFW);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;Ack为照光对照管的吸光度;AE为样品管的吸光度;V为样品液总体积(ml);Vt为测定时的酶液用量(ml);W为样品鲜重(g);蛋白质含量单位为mg/g。
【注意事项】
1.酶液提取须在4℃下进行,提取后立即进行测定,冰箱中放几小时活性也会下降;
2.植物中的酚类物质对测定有干扰,制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或pvpp等,尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
3.NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用,若置于冰箱中要避光保存,充分摇匀然后使用。
4.加反应液时最好在暗光下进行;
5.核黄素产生O2.,NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关,照光强度和时间要严格控制。
光照培养箱内壁裱糊锡箔纸,使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1,同时使照光时间一样,选择试管尽量一致,照光结束后测一个拿一个(最好晚上做)(温度高时照光时间缩短,温度低时延长);
6.测定活性时加入的酶量,以能抑制反应的50%为佳。
(一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量,即以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。
)
(反应液中加酶液与PBS调零差异不大,反应液调零与其它两个则有一定差异。
李合生方法:
2支CK管均以缓冲液代替酶液。
)
【参考文献】
BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1971,44:
276-287.
ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapplicationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinterrape(BrassicanapesL.).J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.
二愈创木酚过氧化物酶(POD)活性的测定----愈创木酚法
【实验原理】
在过氧化物酶催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。
此产物在470nm处有最大光吸收,故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1.分光光度计
2.台式离心机
(二)材料
1.磷酸氢二钠
2.磷酸二氢钠
3.2-甲氧基酚
4.30%H2O2
5.陶瓷小研钵
6.2ml离心管
(三)试剂
1.0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0):
A母液:
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:
取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;
B母液:
0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:
取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制:
分别取A母液(Na2HPO4)12.3ml和B母液(NaH2PO4)87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M,pH6.0);
【实验步骤】
1.酶液提取
称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清夜即为酶粗提液。
2.酶活性测定
(1)反应混合液的配制:
取50mlPBS(pH6.0,0.2M)缓冲液于烧杯中,加入28μl愈创木酚(2-甲氧基酚)于磁力搅拌器上加热搅拌,直至溶解愈创木酚溶解,待溶液冷却后加入19μl30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。
(2)酶活性测定:
取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值在40秒的变化。
以PBS代替酶液为对照调零,
3.计算结果
以每minOD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。
,按下式计算活性
POD活性=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)(u/gFW)
ΔA470:
为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml)。
【注意事项】
1.反应液配制时由于愈创木酚难溶,应加热一段时间。
加入H2O2前注意溶液冷却,防止H2O2的挥发。
2.由于该反应迅速,加入酶液要立即进行吸光值的测定。
参考文献
J.L.Muñoz-Muñoz,F.García-Molina,P.A.García-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.García-Cánovas,J.N.Rodríguez-López,Enzymaticandchemicaloxidationoftrihydroxylatedphenols,FoodChemistry, Volume113,Issue2, 15March2009,Pages435-444
F.Quintanilla-Guerrero,M.A.Duarte-Vázquez,B.E.García-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado,Polyethyleneglycolimprovesphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnology,Volume99,Issue18,December2008,Pages8605-8611
三CAT(过氧化氢酶)的测定
【实验原理】
过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶,它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。
H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1.分光光度计
2.台式离心机
(二)材料
植物叶片等植物材料
(三)试剂
10.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.0):
取A母液(Na2HPO4)228.75ml和B母液(NaH2PO4)146.25ml混合后用蒸馏水定容至500ml。
20.3%H2O2:
吸取0.5ml30%的H2O2,用PBS(pH7.0)定容至50ml。
【实验步骤】
1.酶液提取
称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清夜即为CAT粗提液。
2酶活性测定
(1)反应混合液的配制:
取100mlPBS(0.15M,pH7.0),加入0.1546ml30%的H2O2摇匀即可。
(2)取2.9ml反应液加入0.1ml酶液,以PBS为对照调零,测定OD240值在40s内的变化。
3结果计算:
酶活性计算:
以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位(u)。
CAT=[ΔA240×Vt]/(W×Vs×0.01×t)(u/gFW)
ΔA240:
为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml)。
【注意事项】
H2O2易分解,应现用现配。
【参考文献】
AebiH(1984)Catalaseinvitro.In:
PackerL(ed)Methodsinenzymology.Orlando,FL:
AcademicPress,pp121–126
四抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定
【实验原理】
AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶,催化抗坏血酸(AsA)与H2O2反应,使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。
随着AsA被氧化,溶液的OD290值下降,根据单位时间内OD290的减少值,计算AsA-POD活性。
AsA氧化量按消光系数2.8/(mmol/L)·cm(ε=2.8mM-1.cm-1)计算,酶活性用µmolAsA·g/FW·h表示。
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1.分光光度计
2.台式离心机
(二)材料
1.磷酸氢二钠
2.磷酸二氢钠
3.EDTA-Na2
4.抗坏血酸
5.30%H2O2
6.陶瓷小研钵
7.2ml离心管
(三)试剂
(按50个样计算):
1.0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的配制:
母液的配制方法同前取A母液Na2HPO461.0ml,加入B母液NaH2PO439.0ml,用去离子水定容到400ml。
2.0.1mMEDTA-Na2:
取0.0093gEDTA-Na2用PBS(pH7.0)缓冲液定容到250ml(372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861g);
3.5mMAsA:
取0.044g抗坏血酸用PBS(pH7.0)缓冲液缓冲液定容到50ml(现用现配);
4.20mMH2O2:
取0.2ml30%H2O2用去离子水稀释到100ml。
【实验步骤】
1.酶液提取方法同SOD.
2.酶活性的测定(以2ml体系测定)
(1)(以2ml体系测定)取0.10ml酶液(可视情况调整),加入1.70ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS(0.05mol/L,pH7.0),再加入0.10ml5mM的AsA,最后加入0.10ml20mMH2O2,立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化,计算单位时间内AsA减少量和酶活性(室温下测定,以不加H2O2为空白对照调零)。
(2)若以3ml体系测定,则取0.10ml酶液(可视情况调整),加入2.60ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS(0.05mol/L,pH7.0),再加入0.15ml5mM的AsA,最后加入0.15ml20mMH2O2,立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化
3.酶活性计算
以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u,酶活性以u/g(FW)表示
APX活性(u/g)=△A290.VT/0.01VS.t.W
△A290表示在290nm处吸光值的变化
VT提取液总体积;VS酶液的体积;W叶片的鲜重;t反应时间
【注意事项】
加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。
【参考文献】
NakanoY,AsadaK.1981.Hydrogenperoxidescavengedbyascorbate-specificperoxidaseinspinachchloroplasts.PlantCellPhysiol.22,867-880
五GR(谷胱甘肽还原酶)的测定
【实验原理】
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1.分光光度计
2.台式离心机
(二)材料
1.叶片或根系
2.GSSG
3.NADPH
4.Hepes
(三)试剂
1.Hepes缓冲液(PH7.8):
称取Hepes1.9155g,用蒸馏水定容至200ml
2.10mMGSSG:
称取18.3mgGSSG溶于3ml蒸馏水中
3.2.4mMNADPH:
称取4mgNADPH溶于2ml蒸馏水中
【实验步骤】
1.酶液提取
称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为GR粗提液。
2.GR测定
取样品上清液0.1ml(3次重复),放入试管中,加入Hepes1700ul,NADPH100ul及其GSSG100ul在OD340下测定。
【注意事项】
1.酶液提取须在4℃下进行,提取后立即进行测定,冰箱中放几小时活性也会下降;
2.植物中的酚类物质对测定有干扰,制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或pvpp等,尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
【参考文献】
HongZhu,ZhuoxiaoCao,LiZhang,MichaelA.Trush,YunboLi(2007)Glutathioneandglutathione-linkedenzymesinnormalhumanaorticsmoothmusclecells:
chemicalinducibilityandprotectionagainstreactiveoxygenandnitrogenspecies-inducedinjury.MolCellBiochem301:
47–59.
WheelerCR,SalzmanJA,ElsayedNM,OmayeST,KorteDW(1990)Automatedassaysforsuperoxidedismutase,catalase,glutathioneperoxidase,andglutathionereductaseactivity.AnalBiochem184:
193–199.
六O2-产生速率的测定
【实验原理】
O2-与羟胺反应产生NO2-,NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下,生成粉红色的偶氮染料,该染料在530nm处有最大光吸收,根据OD530可计算出样品中的O2-的含量。
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1.分光光度计
2.台式离心机
(二)材料
1.叶片或根系
2.磷酸氢二钠
3.磷酸二氢钠
4.盐酸羟胺
5.对氨基苯磺酸
6.α-萘胺
7.冰醋酸
(三)试剂
1.0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):
A母液:
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:
取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;
B母液:
0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:
取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/LPBS(pH7.8)的配制:
分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml,B母液(NaH2PO4)21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。
2.10mM盐酸羟胺:
称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。
3.17mM对氨基苯磺酸:
称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液(冰醋酸:
水=1:
3)定容至100ml
4.7mMa-萘胺:
称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液(冰醋酸:
水=3:
1)定容至100ml。
【实验步骤】
1.酶液提取
称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为酶-粗提液。
2.O2-产生速率测定
(1)取0.5ml提取液中加入0.5mlPBS(0.05M,pH7.8),1ml10mM盐酸羟胺溶液后摇匀,同时做一对照管以PBS代替样品提取液;
(2)在25℃下保温1小时,若测定叶片保温后需加入2ml乙醚萃取Chl;
(3)依次先加入1ml17mM对氨基苯磺酸,再加入1ml7mMα-萘胺,混合后涡旋;
(4)在25℃下保温20min后在3000g离心3min;
(5)以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。
3.计算结果
根据测得的OD530,查NO2-标准曲线得到[NO2-],依照羟胺与O2-的反应式:
NH2OH+2O2-+H+NO2-+H2O2+H2O计算[O2-],即[NO2-]×2=[O2-]。
再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量,求得O2-产生速率(nmolmin-1mg-1蛋白,也可用nmolmin-1g-1鲜重)。
【注意事项】
1.样品中若含有大量叶绿素将干扰测定,可在样品与羟胺温浴后,加入等体积的乙醚萃取叶绿素,再加入对氨基苯磺酸和α-萘胺作NO2-的显色反应;
2.应用羟胺反应来检测生物材料的含量,必须严格控制反应系统的pH(<8.0,并尽可能降低反应液中的溶解氧和Fe的含量。
因为羟胺自动氧化随反应系统的pH值升高而加强,同时随反应液的溶解氧和Fe含量的增加而加强。
【参考文献】
DesenKe,GuchouSun,ZhengxunWang(2007)EffectsofsuperoxideradicalsonACCsynthaseactivityinchilling-stressedetiolatedmungbeanseedlings.PlantGrowthRegul51:
83–91.
WangAG,LuoGH(1990)Quantitativerelationbetweenthereactionofhydroxylamineandsuperoxideanionradicalsinplants.PlantPhysiolCommun6:
55–57.
七碘化钾分光光度法测定过氧化氢(H2O2)的含量
【实验原理】
过氧化氢(H2O2)既是一种较强氧化剂,又是一种较弱还原剂。
它存在范围广,化学性质活泼,对生命体代谢、物质结构性能和环境保护等都有影响。
过氧化氢可以与碘化钾发生反应:
H2O2+2KI→I2+2KOH
I2通常以I3-的形式存在于水溶液中。
利用I3-在352nm有吸收峰这一原理,用分光光度法测定过氧化氢,方法快速简便,干扰少,仪器普及。
【仪
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