流式细胞仪检测细胞周期操作步骤.docx
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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
取对数生长期的A549细胞,按1×106cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内
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24h后,进行所需的处理(比如加药,照射)
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特定时间后终止培养,进行下一步的实验
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收集原培养液,洗后的PBS和消化后的细胞,将三者混匀放入15ml离心管中
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1000rpm离心5min(短时低速离心)
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弃上清,用1.5ml预冷PBS,1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片
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加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇,混匀后,于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
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1000r/min,离心5min
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将乙醇吸除,加PBS清洗混匀
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1000r/min,5min再离心一遍,将残留在细胞上的乙醇除去
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吸除离心管内PBS,加入200ulPBS和2ul的RNA酶(0.25mg/ml)(37℃下孵育30min)
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加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min
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将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中(PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团),标记EP管
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开机(先开仪器后开软件)
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流式细胞仪的结构一般分为5部分:
①流动室及液流驱动系统;②激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测、存贮、显示、分析系统;⑤细胞分选系统。
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检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞,然后插入流式细胞仪上
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流动室内充满鞘液,细胞排成单列由喷嘴中心喷出,形成细胞液柱
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液柱与激光束相交,细胞上的荧光染料被激发产生荧光(488nm激发光源)
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荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析(荧光染料和细胞DNA分子特异性结合,可以检测出细胞周期各时相细胞比例)
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在用第三方软件分析之前,将流式结果按如下所示导出
结果分析——Modfit软件分析
图片拷贝:
直接Ctrl+C
——Flowjo软件分析
FCM-DNA量分析1个细胞增殖群时,可将DNA含量分布组方图分为三部分,即G0/1、S、G2M。
G0/1和G2M细胞峰的DNA分布均为正态分布,S期可以认为是一个加宽的正态分布
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检测结果刻录光盘保存
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关机(先关软件后关仪器,关机前需清洗)
正常细胞DNA含量:
2n-4n
凋亡细胞:
核内DNA断裂,乙醇固定后膜通透性增加,小片段DNA穿膜丢失,胞内DNA含量减少。
PI染色后,荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区(亚G1峰)。
1、纵坐标CellNumber:
即计数的有效细胞数;
2、横坐标DNAContent:
即DNA含量;
3、G1、G2、S三期在图中已经标示;
4、右侧数字含义:
DipG1-53.84%at55.56,即G1期DNA含量平均值为55.56;53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%;DipG2-5.64%at107.72,即G2期DNA含量平均值为107.72,5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%;
AnnexinV-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡
基本原理:
磷脂酰丝氨酸(PS)能与连接素Ⅴ(AnnexinⅤ)发生特异结合;PI是核酸荧光染料,不能透过正常细胞膜,只能进入已经破损的细胞膜,在嵌入双链DNA后释放红色荧光,荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。
正常细胞:
膜完整,PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ-
凋亡早期:
膜完整,PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+
凋亡晚期:
PS外翻,膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+
坏死细胞:
膜严重破损,PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
实验步骤:
取对数生长期的细胞,按1×106cells/mL以1mL接种于培养皿内
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24h后,进行所需的处理(比如加入药物)
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特定时间后终止培养,进行下一步的实验
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细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不易过长,以防引起假阳性)
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加入PBS制成细胞悬液(移液枪吹打6-8次)
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倒置显微镜下观察细胞状态(单个分离悬浮)
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将细胞悬液移入15ml离心管中
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2000rpm离心5min,PBS吸除
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用PBS清洗细胞2次(2000rpm,离心5min收集细胞)
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用400ul1×BindingBuffer悬浮细胞(浓度大约为1×106cells/ml)
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在细胞悬液中加入5ulAnnexinV-EGFP,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15min
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加入10ulPI后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5min
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在1h内用流式细胞仪检测
流式细胞仪激发光波长采用Ex.=488nm双波长激发,Em.=510nm检测EGFP荧光(FL1channel)和>575nm的发射波长检测PI。
细胞应可分成三个亚群:
活细胞仅有很低的荧光强度,凋亡细胞有较强的绿色荧光,坏死细胞(包括极晚期凋亡细胞)有绿色和红色荧光双重染色。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞,为(AnnexinV-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为AnnexinV+/PI+;而右下象限为凋亡细胞,显现AnnexinV+/PI-。
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