吉林大学《生物化学含实验》期末考试备考资料十三.docx
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吉林大学《生物化学含实验》期末考试备考资料十三
吉大《生物化学(含实验)》(十三)
第十三章蛋白质的生物合成
信使RNA
MessengerRNA(mRNA)——信使核糖核酸
基本信息
携带遗传信息,在合成时充当的。
从(DNA)合成的带有的一类单链(RNA)。
它在上作为蛋白质合成的模板,决定的排列顺序。
mRNA存在于和的及的某些(如和)中。
原核生物和真核生物mRNA有不同的特点:
①原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。
真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。
②原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的,真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工,加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作。
③原核生物mRNA半寿期很短,一般为几分钟,最长只有数小时(RNA噬菌体中的RNA除外)。
真核生物mRNA的半寿期较长,如胚胎中的mRNA可达数日。
④原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。
原核生物mRNA一般5′端有一段不翻译区,称前导顺序,3′端有一段不翻译区,中间是蛋白质的编码区,一般编码几种蛋白质。
真核生物mRNA(细胞质中的)一般由5′端帽子结构、5′端不翻译区、翻译区(编码区)、3′端不翻译区和3′端聚腺苷酸尾巴构成分子中除m7G构成帽子外,常含有其他修饰核苷酸,如m6A等。
真核生物mRNA通常都有相应的前体。
从DNA转录产生的原始转录产物可称作原始前体(或mRNA前体)。
一般认为原始前体要经过hnRNA核不均-RNA的阶段,最终才被加工为成熟的mRNA。
通常mRNA(单链)分子自身回折产生许多双链结构。
原核生物,经计算有%的核苷酸以双链结构的形式存在。
真核生物mRNA也具有丰富的二级结构,折叠起来的mRNA二级结构有利于蛋白质合成的启动,以后mRNA处于伸展的状态则有利于转译的继续。
mRNA的复制,转录和翻译:
由一个DNA分子,边解旋,边转录。
利用细胞核内部的游离核糖核苷酸和成其需要的碱基,规则遵循碱基互补配对原则。
注:
因为mRNA没有T(胸腺嘧啶),所以模版中出现A(腺嘌呤)时,有U(尿嘧啶)代替。
以上过程叫做转录,在细胞核中完成。
接着,mRNA穿过核孔。
和细胞质中的核糖体结合。
选择tRNA运输氨基酸,和对应的三个碱基排列好(如何排列请查询:
密码子)。
再与其它的氨基酸通过肽键连接在一起,形成肽链。
以上过程叫做翻译,在细胞质中完成。
虽然人们已经破译了决定生命基础的蛋白质的氨基酸合成密码,也知道了是DNA携带着这种密码,但是,根据细胞学所掌握的事实:
所有DNA都呆在细胞核内,而蛋白质却存在于细胞质中,像DNA这样的大分子是无法随意进入细胞质的。
然而密码总是会被带入细胞质的,这一来,人们不禁要问,是谁把锁在细胞核内的DNA手里的密码带入了细胞质的呢?
科学家们从DNA那里拷贝了一份密码文件,并带入了细胞质中。
经过试验和观察,发现这个信使就是RNA——核糖核酸。
信使RNA的发现
储存在DNA分子中的这种遗传信息能在复制中产生更多的拷贝,并翻译成蛋白质。
DNA的功能构成了信息的流动,遗传信息如何转变成蛋白质呢?
转录就是其中的重要的一环。
基因表达时以DNA的一条链为模板合成RNA,这一过程就是转录(transcription)。
催化合成RNA的酶叫做RNA聚合酶(RNApolymerase)。
RNA和DNA结构相似,所不同之处在于:
(1)RNA一般以单链形式存在;
(2)RNA中的核糖其C′-2不脱氧;(3)尿苷(U)取代了DNA中的胸苷。
细胞中的RNA分成三种:
mRNA(信使RNA),tRNA(转运RNA)和rRNA(核糖体RNA)。
它们的功能各不相同。
mRNA是合成蛋白质的模板,tRNA是转运特异氨基酸的运载工具,rRNA是合成蛋白质的装置。
mRNA的碱基序列,决定着蛋白质装配时氨基酸的序列。
1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行了实验;若加入RNA酶降解细胞中的RNA,则蛋白质合成就停止,若再加入从酵母中提取的RNA,则又可以重新合成一些蛋白质,这就表明,蛋白质的合成是依赖于RNA。
同年Goldstein和Plaut用同位素标记(Amoebaproteus)RNA前体,发现标记的RNA都在核内,表明RNA是在核内合成的。
在标记追踪(pulse-chase)实验中,用短脉冲标记RNA前体,然后将细胞核转移到未标记的变形虫中。
经过一段时间发现被标记的RNA分子已在细胞质中,这就表明RNA在核中合成,然后转移到细胞质内,而蛋白质就在细胞质中合成,因此RNA就成为在DNA和蛋白质之间传递信息的信使的最佳候选者。
1956年ElliotVolkin和LawrenceAstrachan作了一项很有意思的观察:
当被T2感染,迅速停止了RNA的合成,但噬菌的RNA却开始迅速合成。
用同位素脉冲一追踪标记表明噬菌的RNA在很短的时间内就进行合成,但很快又消失了,表明RNA的半衰期是很短的。
由于这种新合成的RNA的碱基比和T2的DNA碱基比相似,而和细菌的碱基比不同,所以可以确定新合成的RNA是T2的RNA。
由于T2感染细菌时注入的是DNA,而在细胞里合成的是RNA,可见DNA是合成RNA的模板。
最令人信服的证据来自DNA-RNA的杂交实验。
和Spiegeman,S,将T2噬菌体感染后立即产生的RNA分离出来,分别与T2和的DNA进行分子杂交,结果发现这种RNA只能和T2的DNA杂交形成“杂种”链,而不能和的DNA进行杂交。
表明T2产生的这种RNA(即mRNA)至少和T2的DNA中的一条链是互补的。
Brenner,s.Jacob,F.和Meselson(1961)进行了一系列的的实验,他们将培养在15N/13C的培养基中,因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所标记。
也就是说凡是“重”的核糖体,RNA和蛋白都是细菌的,然后用T2感染,细菌的RNA停止合成,而开始合成T2的RNA此时用普通的“轻”培养基(14N/12C),但分别以32P来标记新合成的T2RNA,以35S标记新合成的T2蛋白,因此任何重新合成的核糖体,RNA,及蛋白都是“轻”的但带但有放射性同位素。
经培养一段时间后破碎细胞,加入过量的轻的核糖体作对照,进行密度梯度离心,结果“轻”的核糖体上不具有放射性,“重”的核糖体上具有32P和35S,表明
(1)T2未合成核糖体,“轻”核糖体却是后加放的。
(2)T2翻译时是借用了细菌原来合成的核糖体,所以核糖体并无特异性,核糖体上结合的mRNA,其序列的特异性才是指导合成蛋白质的遗传信息,从而提出了mRNA作为“信使”的证据。
因此他们将这种能把遗传信息从DNA传递到蛋白质上的物质称为“信使”。
他们预言
(1)这种“信使”应是一个多核苷酸;
(2)②其平均分子量不小于5´105(假定密码比是3),足以携带一个基因的遗传信息;(3)它们至少是暂时连在核糖体上;(4)其碱基组成反映了DNA的序列;(5)它们能高速更新。
Volkin和Astrachan发现高速更新的RNA似乎完全符合以上条件。
Jacob和Monod将它定名为信使RNA(MessengerRNA)或mRNA。
信使RNA的合成与加工
第一节DNA转录生成RNA
一、定义
(一)转录单位
(二)启动子(promoter)
(三)终止子(terminator)
二、RNA聚合酶
(一)酶的特性:
以4种NTP为底物,需模板和镁离子,合成方向也是5’-3’,但不需要引物。
(二)酶的分类:
1.噬菌体的RNA聚合酶结构简单,是单链蛋白,功能也简单。
2.细菌则具有复杂的多亚基结构(450Kd),可识别并转录超过1000个转录单位。
3.真核生物的酶有多种,根据a-鹅膏蕈碱(环状8肽,阻断RNA延伸)的抑制作用可分为三类:
聚合酶A对它不敏感,分布于核仁,转录核糖体RNA;聚合酶B对低浓度敏感,存在于核质,转录信使RNA;聚合酶C位于核质,对高浓度敏感,转录小分子量RNA,如转运RNA、5SRNA等。
各种RNA聚合酶都是由10-15种不同亚基组成的多亚基复合物。
4.线粒体和叶绿体也有RNA聚合酶,结构简单,能合成所有种类RNA。
(三)酶的构成:
大肠杆菌的全酶有5个亚基(α2ββ’ωσ),含2个锌。
β催化形成磷酸二酯键,β’结合模板,σ亚基称为起始因子,可使RNA聚合酶稳定地结合到启动子上。
ββ’ωσ称为核心酶。
σ亚基在不同菌种间变动较大,而核心酶比较恒定。
酶与不同启动子的结合能力不同,不同启动因子可识别不同的启动子。
σ70识别启动子共有序列,σ32识别热休克基因,σ60在氮饥饿时起作用。
σ通过随机移动起作用,不需解链。
(四)模板:
以完整双链DNA为模板,其中仅一条链可转录。
转录时局部解链,转录后DNA重新形成双螺旋结构,所以DNA是全保留的。
三、转录过程
分为起始、延长和终止三个阶段。
起始包括对双链DNA特定部位的识别、局部(17bp)解链以及在最初两个核苷酸间形成磷酸二酯键。
第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点。
起始后起始因子离开,核心酶构象改变,沿模板移动,转录生成杂交双链(12bp),随后DNA互补链取代RNA链,恢复DNA双螺旋结构。
延伸速度为50nt/s,酶移动17nm。
错误几率为10-5。
聚合酶到达终点时,在终止辅助因子的帮助下停止反应,酶和RNA链脱落,转录结束。
四、启动子和转录因子
(一)定义:
酶识别、结合、开始转录的一段DNA序列。
强启动子2秒钟启动一次转录,弱启动子10分钟一次。
(二)原核生物:
大肠杆菌在起点上游约-10碱基对处有保守序列TATAAT,称为pribnowbox,有助于局部解链。
在其上游还有TTGACA,称为-35序列,提供RNA聚合酶识别的信号。
(三)真核生物:
复杂,差异较大。
1.信使RNA的启动子通常有三个保守区,-25到-30有TATA框,是解链位置,并决定转录起点;-75位置有CAAT框,与RNA聚合酶的结合有关;更上游还有GC框,某些转录因子可结合。
后两个称为上游因子,对转录起始频率有较大影响。
2.小RNA的启动子在转录区内部,有一些辅助因子帮助RNA聚合酶识别。
五、终止子和终止因子
(一)定义
(二)所有原核生物的终止子在终点之前都有一个回文结构,可使酶减慢移动或暂停合成。
大肠杆菌有两类终止子:
1.简单终止子,回文区有一段富含GC对的序列,回文后有寡聚尿苷。
2.依赖ρ的终止子,必须在有ρ因子时才能发挥作用,不含GC对,也无寡聚尿苷。
ρ因子是蛋白质,可与酶作用,释放RNA,并使酶脱离。
(三)某些因子可使酶越过终止子继续转录,称为通读。
常见于某些噬菌体的时序控制,早期基因与晚期基因以终止子相隔,早期基因产生抗终止因子,使发生通读以表达晚期基因。
六、转录的调控
(一)遗传信息的表达有时序调控和适应调控,转录水平的调控是关键环节,因为这是表达的第一步。
转录调控主要发生在起始和终止阶段。
(二)操纵子是细菌基因表达和调控的单位,有正调节和负调节因子。
阻遏蛋白的作用属于负调控。
环腺苷酸通过其受体蛋白(CRP)促进转录,可促进许多诱导酶的合成。
操纵子可构成综合性调控网络,如SOS反应等。
对终止子也有调控作用,如衰减子。
(三)真核生物不组成操纵子,而是通过激素、生长因子等进行调控。
某些DNA序列对转录起增强作用,称为增强子。
第二节转录后加工
一、原核生物
(一)核糖体RNA:
大肠杆菌共有7个核糖体RNA的转录单位,每个转录单位由16S、23S、5SRNA和若干转运RNA基因组成。
16S和23S之间常由转运RNA隔开。
转录产物在RNA酶III的作用下裂解产生核糖体RNA的前体P16和P23,再由相应成熟酶加工切除附加序列。
前体加工时还进行甲基化,产生修饰成分,特别是a-甲基核苷。
N4,2’-O二甲基胞苷(m4Cm)是16S核糖体RNA特有成分。
5S核糖体RNA一般无修饰成分。
(二)转运RN
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